论文部分内容阅读
糖胺聚糖(glycosaminoglycans, GAGs)是一类带有负电荷的长链大分子多糖,它由重复的二糖单元结构组成,其中的双糖单位是N-位乙酰化或硫酸化的己糖胺与一个糖醛酸以共价键连接起来的结构。根据双糖单位的不同,糖胺聚糖包括透明质酸(hyaluronic Acid, HA),硫酸软骨素(chondroitin sulfate, CS)和硫酸乙酰肝素(heparan sulfate, HS)等。其中,HA的重复二糖单元是β1,4连接的葡糖醛酸(glucuronic acid, GlcUA)和p1,3连接的N-位乙酰化的葡糖胺(N-acetylglucosamine, GlcNAc)。HA以蛋白聚糖的形式广泛存在于动物组织的细胞外基质中,其在细胞的发育、修复过程中发挥着重要作用,还是一些角膜、软骨、肌腱、皮肤、结缔组织等机体系统的重要组成成分。由于HA分子良好的亲水性和黏弹性,其在医学中应用于关节炎、眼科疾病及其他一些疾病的治疗,另外也广泛应用于化妆品及保健品中。来源于革兰氏阴性A型巴斯德杆菌(Pasteurella multocida Type A)的HA聚合酶(pmHAS)属于二型(Class II)聚合酶,含有972个氨基酸残基,具有相对独立的两个糖基转移酶活性区域。pmHAS1-703是可溶性的蛋白,分别以GlcNAc和GlcUA核苷酸活化的单糖作为供体,依次催化两种单糖连接合成到糖链受体的非还原端,不断地延长糖链。pmHAS以及几种糖核苷酸合成酶的一锅多酶体系可以利用相对便宜的底物来合成HA寡糖以及其TFA修饰的HA衍生物,节约了成本,简化了反应过程以及纯化步骤。其中TFA修饰的HA衍生物用来进行硫酸化HA生成的研究,进而用来验证HA硫酸化衍生物是否具有抑制人源HA酶的活性而有效延长注射HA在体内的作用时间。本论文研究内容和结果如下：(1)构建了Pasteurella multocida Type A的HA聚合酶(pmHAS)的重组表达系统；确定了pmHAS诱导表达及纯化的条件。(2)初步分析了重组pmHAS的单糖供体及受体的底物适应性：除HA骨架外,与HA具有相同糖苷键连接形式的CS寡糖也可以作为pmHAS的合成受体；而HS骨架寡糖由于其糖苷键连接形式与HA差异较大,不能作为该酶的底物。(3)构建了Arabidopsis thaliana的葡萄醛酸激酶(AtGlcAK)重组表达系统,确定AtGlCAK的表达纯化条件,与UDP-sugar焦磷酸化酶(USP)合用体外酶法合成糖供体UDP-GlcUA,从而解决了糖核苷酸价格昂贵的难题。(4)利用pmHAS以及几种糖核苷酸合成酶的一锅多酶法合成出HA寡糖以及其TFA修饰的HA衍生物,节约了成本,简化了实验过程和纯化步骤。