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龙眼(Dimocarpus longan L.)属于无患子科龙眼属植物,具有丰富的使用价值。本课题组前期通过转录组测序,筛选到普通龙眼品种’立冬本’和具有一年多次开花特性的龙眼品种’四季蜜’中的差异表达基因 EARLY FLOWERING 4(EF4)和 TERMINAL FLOWER 1(TFL1),克隆得到了 DlELF4-1、DlELF4-2、DlTFL1-1、DlTFL1-2 四个基因的cDNA编码区全长序列。本试验在此基础上,通过转化拟南芥和普通烟草,初步研究四个基因的功能。同时,对龙眼病毒诱导基因沉默技术(VIGS)进行初步探究,并构建DlTFLl-1和DlTFL1-2基因的TRV(tobacco rattle virus)病毒载体,为进一步研究基因功能奠定基础。本试验主要获得了以下研究结果:1.将DlELF4-1和DlELF4-2基因采用“浸花法”转化野生型拟南芥,通过连续3代筛选得到纯合的转基因植株。以野生型拟南芥为对照,分别在长日照和短日照条件下观察转基因植株的表型变化。研究发现,在长日照条件下,野生型拟南芥开花时间平均为27.0 d,转DlELF4-1基因3个株系植株开花时间分别为38.6±1 d、35.3±2 d、40.3±1 d,转DlELF4-2基因3个株系植株开花时间分别为34.0±1 d、36.6±1d、34.3±2d;短日照条件下,野生型拟南芥的开花时间平均为39.6 d,转DlELF4-1基因3个株系植株开花时间分别为48.6±1 d、47.3±1 d、56.0±3 d,转DlELF4-2基因3个株系植株开花时间分别为44.0±2d、46.3±1d、51.6±2d,同时均出现莲座叶数目增多和不定根生长现象。此外还发现,DlELF和DlELF4-2转基因植株在短日照条件下叶片边缘呈锯齿状。由此推测DlELF4既有延迟开花的功能,也有调控生长素合成的功能。qPCR分析拟南芥AtGI、AtFKF1基因在转基因植株中的表达量,结果显示,在DlELF4-1和DlELF4-2转基因植株的根和叶片中,AtGI和AtFKF1基因表达量上升。结合前期基因在龙眼花芽分化过程的表达分析,推测在龙眼花芽分化过程中,DlELF4-1可能主要起抑制开花的作用,而DlELF4-2主要调控生长素的合成。2.将DlTFL1-1和DlTFL1-2基因用“浸花法”转化野生型拟南芥,在长日照和短日照条件下观察转基因植株的表型变化。研究发现,在长日照条件下,野生型拟南芥的开花时间平均为27.0d;转DlTFL1-1基因3个株系植株开花时间分别为35.0± 1 d、37.3±1 d、38.3±1 d;转DlTFL1-2基因3个株系植株开花时间分别为32.0±1 d、34.6±1 d、33.0±2d;短日照条件下,野生型拟南芥的开花时间平均为39.6 d;转DlTFL1-1基因3个株系植株开花时间分别为42.6±2 d、45.3±1 d、46.0±3 d;转DlTFL1-2基因3个株系植株开花时间分别为42.0±1 d、41.0±1d、43.2±1d。同时伴随莲座叶数目增多和不定根生长,但不定根生长现象没有DlELF4-1和DlELF4-2转基因植株明显。此外,DlTFL1-1和DlTFL1-2转基因植株开花时分支明显增多,而花序结构没有发生改变。综合试验结果推测,DlTFLi基因在龙眼花芽分化过程中可能通过延长植株的营养生长期来抑制开花。3.DlELF4-1、DlELF4-2、DlTFL1-1、DlTFL1-2 四个基因利用“叶盘法”转化普通烟草。DlELF4-1和DlELF4-2转基因植株均出现延迟开花现象,进一步证明DlELF4基因可能有抑制开花的功能,DlFL1-1和DlTFL1-2转基因植株同样出现延迟开花现象,且植株生长更高大。结合前期基因在龙眼花芽分化过程的表达分析,推测龙眼DlTFL1-1基因可能具有调控童期的作用,而DlTFL1-2基因可能通过维持营养生长来抑制开花。4.对龙眼VIGS(病毒诱导基因沉默)技术进行初步探究。试验利用带有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的TRV病毒载体侵染本氏烟草叶片和龙眼种子的根和子叶。采用真空浸入法和注射法侵染龙眼种子,选取OD600值为0.5、1.0、1.5的侵染液,真空浸入法抽取真空时间分别为5 min、10 min、20 min。侵染10 d后,紫外灯照射本氏烟草叶片和龙眼种子根部,均出现绿色荧光,且PCR检测条带正确。结果显示当OD值为1.5,真空浸入10-20 min时效果较好。此外实验还构建了龙眼DlTFL/-1和DlTFL1-2基因的TRV(tobacco rattle virus)病毒载体,为进一步研究基因的功能奠定基础。