肺发育相关疾病如呼吸窘迫综合征(respiratory distress syndrome, RDS)、支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia, BPD)等是新生儿科的常见病、难治病,也是临床上早产儿、极低出生体重儿死亡的重要病因。RDS是由于肺表面活性物质(pulmonary surfactant, PS)分泌不足所致,BPD主要是由于未成熟肺因感染、高氧等多种因素所致肺损伤并出现异常修复,而肺泡Ⅱ型上皮细胞(type Ⅱ alveolar epithelial cell, AECII)的功能成熟是PS分泌和肺损伤修复的基础,因此,探索AECⅡ功能成熟及调控机制并在其中发现新的作用机制及干预靶点,对肺发育相关疾病的防治及药物研发等可能产生重要影响。AECII是哺乳动物肺泡上皮细胞的主要组成部分,与肺发育相关疾病有着密切联系。在功能上,AECII -方面可通过分泌肺表面活性物质,降低肺泡张力,保持肺的顺应性；另一方面,AECⅡ还可作为干细胞增殖转分化为肺泡I型上皮细胞(type Ⅰ alveolar epithelial cell, AECI),在肺损伤修复中发挥重要作用。此外,AECII在维持肺泡内外液体平衡及免疫调节方面也起着十分重要的作用。因此,AECII发育不成熟或功能缺陷会导致多种新生儿肺部疾病。目前,尚未建立用于长期研究的正常AECⅡ细胞株,而来自肺腺癌组织的A549细胞在功能上并不能完全替代正常的AECII,因而,目前用于研究的AECII大多由成年大鼠肺组织中分离培养而得。由于本课题组的主要研究方向是探讨新生儿尤其是早产儿肺部疾病,且孕19天胎鼠肺组织的生物学特性与早产儿肺组织生物学特性极为相似,能够满足本研究需要。故本课题第一部分主要研究了从孕19天胎鼠肺组织中分离培养AECⅡ的方法,并对分离培养的AECⅡ进行了一系列鉴定及分析,寻找其用于体外研究的最佳培养时期。MicroRNA (miRNA)是近年来发现的一类重要的短小内生RNA,它可通过对靶向mRNA的直接降解或抑制转录而阻止其翻译、表达,从而在转录后水平参与基因的表达调控。目前一致认为miRNA在细胞发育时序、细胞增殖、信号转导、干细胞分化和肿瘤的发生发展等生物过程中起着非常重要的作用。MiR-146b是一在脊椎动物中高度保守的miRNA,已有研究证实它在抑制肿瘤发展、细胞分化、增殖等多种生物过程中起着重要作用。在前期研究中,我们发现miR-146b在胎肺发育晚期不同阶段的表达具有显著差异性,而胎肺发育晚期是AECII逐渐成熟并开始具有功能的关键时期,因此,我们推测miR-146b可能对AECII的成熟和功能发挥有一定影响。为此,我们构建了过表达miR-146b的AECI I,检测其对AECII曾殖、转分化、表面活性物质相关蛋白(surfactant proteins, SPs)表达的影响,并初步探索了其潜在的作用靶标,为揭示新生儿肺发育相关疾病的发生机制提供了新的理论依据。第一部分胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离培养及ABCA3表达变化的研究目的： 观察原代培养胎鼠AECⅡ的生长状况及特异性蛋白ATP结合盒转运蛋白A3 (ATP binding cassette transporter A3, ABC A3)在不同时间的表达变化,为新生儿肺发育及肺部疾病发生机制的相关研究提供一些实验依据。方法： 首先采用胰酶联合胶原酶消化肺组织,并以差速离心及差速贴壁法纯化细胞；随后分别应用电子显微镜鉴定AECⅡ细胞；应用倒置相差显微镜观察不同时间点细胞生长状态；并且采用MTT法绘制细胞生长曲线；应用免疫荧光技术观察ABCA3在不同时间点动态表达变化。结果： 电镜下观察到AECⅡ内特征性板层小体大小及数量不等,胞膜外缘分布有刺状微绒毛；应用MTT法测得铺板后第24h、36h、48h、72h、96h、120h的OD值分别为0.177±0.009,0.193±0.011,0.212±0.019,0.253±0.019,0.243±0.012,0.192±0.011。光学显微镜下可见AECⅡ细胞形态随时间变化而逐渐拉长,变扁平,细胞内颗粒逐渐减少。免疫荧光示ABCA3表达随时间变化而逐渐下降。结论： 原代培养的胎鼠AECⅡ在培养早期(即培养72h以内)生长状况最佳,ABCA3表达最丰富,提示培养早期为研究胎鼠AECⅡ功能及影响机制较为理想的时间段。第二部分MiR-146b过表达对肺泡Ⅱ型上皮细胞的功能影响及机制研究目的：探讨miR-146b对原代培养AECⅡ生理功能的影响及其潜在的调控机制,为新生儿肺发育调控机制的深入研究提供一些理论依据。方法：首先我们构建了包含大鼠miR-146b前体序列及两侧侧翼序列的miR-146b腺病毒表达质粒载体pAd-GV275 CMV-rno-mir-146b,然后在HEK293T细胞中包装表达miR-146b的腺病毒及不表达miR-146b的对照腺病毒,再分别感染原代培养的AECII,以等量不含病毒的转染试剂转染的AECII作为空白对照。用real-time PCR法验证过表达效果后,分别用MTT法、免疫荧光法、real-time PCR和western blot法检测这三组细胞的增殖、转分化、部分SPs和表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)表达等的差异性。结果：在AECⅡ培养的第48h和72h时,过表达miR-146b组的细胞增殖较空白对照组和阴性对照组有所降低(P<0.05)；但免疫荧光显示于AECⅡ培养的第5天,空白对照组和过表达miR-146b组ABCA3和水通道蛋白5 (aquaporin 5,AQP5)的表达无差异性。于AECⅡ培养的第3天,过表达miR-146b组细胞的SP-B mRNA表达较空白对照组和阴性对照组明显降低(P<0.01),但SP-C mRNA和蛋白表达无明显差异(P>0.05)。此外,在AECⅡ培养第3天时,过表达miR-146b组细胞的EGFR mRNA和其蛋白表达均低于两组对照组(P<0.05)。结论：MiR-146b负向调控原代培养AEC Ⅱ的增殖和SP-B表达,且这种负向调控机制可能与miR-146b下调EGFR基因有关。