拮抗细菌对水稻纹枯病的生物防治研究

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本研究针对四川稻区的主要纹枯病菌丝群AG-I,用点接法初选和对峙法检测,筛选到大量的拮抗菌株,结合离体防效及对峙实验进一步定选了拮抗作用较强的菌株。利用这些菌株开展了喷施浓度、喷施时间以及在水稻植株上的定殖模式研究,以此为基础进行了田间防效测定。对其进行的生理、生化特性研究,确定了它们在微生物学上的分类地位。从拮抗蛋白的角度进行了拮抗机理的探讨,分离纯化了杀菌蛋白,为进一步克隆相关基因打下基础。此外,对菌株的抗生性、促生性以及生物学特性进行了研究,为在生产上大规模应用开发作了初步探索。取得的主要结果如下: 1.从健康的水稻植株、感染纹枯病(Rhizocotonia.sonali)的水稻植株根系、茎、叶以及根际土壤、秧田水、菌核上分离出了能拮抗纹枯病的细菌近150株。通过对峙法测定,大多数菌株对纹枯病菌丝有较强的抑制作用。选用其中拮抗作用强,具有代表性的5个菌株T122、B34、G22、H50、B25作进一步测定,其抑菌带宽度分别为11.0、10.3、9.7、9.0、7.25mm。 2.经过离体纹枯病防效测定表明,H50、B34、G22的离体防效较好。以清水处理为对照,防效分别可达42.0%、51.0%、47.0%。 3.用菌株H50、B34进行定殖研究,喷施后20d,在水稻植株上只有较低浓度,而在13d左右喷施一次PDA(琼脂除外)营养液后,菌株的生长量逐渐回升,达到并维持一个较高浓度水平。有效喷施浓度直接 拮抗菌的定殖,浓度较低不利于成功定殖,维持较高的有效浓度,可提高防效。喷施菌液过早或接种纹枯病菌过迟,防效较差,以接种纹枯病菌2d后喷施菌液,发病级数最小。 4.在田间小区实验中,测定了拮抗菌菌液浸种和喷施处理对水稻纹枯病菌的防治效果以及对水稻产量因素的影响,以黄绿木霉、井冈霉素、清水为对 照。结果表明,浸种处理中,B34防效较好,可达到48.74%,而H50可提高 分菜数、株高和实粒数。喷施处理中,H50防效达60.75%,三种生防菌(H50、 B34及 G22)和井冈霉素混施处理,防效可达 67.96%,显著高于井冈霉素对照。 混合菌液及H50菌液喷施对实粒数、千粒重、结实率和穗长均有明显的促进 作用。 5.对桔抗表现好的5个菌株H50、B34、B25、G22及T122利用光学显微 镜和扫描电镜分别检测其抗生性即抑菌率、致畸性、对菌核的萌发与形成的影 响度等,桔抗物质对纹枯病菌丝有溶解、断裂、扭曲、缢缩等致畸效应。此外, 对水稻稻瘟病菌的对峙培养,H50有较强的桔抗活性。 6.在液培条件下检测桔抗菌对水稻的出苗率、叶片、根系干重的影响, T122、H50、B25对苗期的地上部分和地下部分均有一定的促生作用。 7.通过对防效表现较好的B34、H50茵株进行光学显微镜和电子显微镜镜 观察、细胞壁化学成分分析以及生理、生化特性的分析,B34属于致黄假单抱 杆菌,H50属于球抱链霉菌。 8.通过对几种拈抗菌的生物学特性的研究,其生长曲线符合细菌生长的 基本生长特性。其生长受到培养基种类、温度、酸碱度、供氧量等因素的影响, 并与其桔抗活性有关。 9.在桔抗代谢物分析中,B34、H50菌株未产生挥发性桔抗物。对培养物 进行PEG20000浓缩,透析后进行蛋白酶敏感验证实验,其中B34对蛋白酶K 和胰蛋白酶敏感,H50对蛋白酶不敏感。用 70%饱和度的中性盐州H/卢 进 行沉淀,得到B34的初提桔抗蛋白,利用SphadexG-100凝胶LKB柱层析以及 DEAE-纤维素{2 LKB柱层析纯化,收集活性峰,浓缩后得到纯化杀菌蛋白,龟 经SDS-PAGE分析,达到电泳纯,分子量约为33KD。
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