D-氨基酸作为一类手性化合物，在医药、农业和食品等领域中的用途正在被广泛而迅速地挖掘。但D-氨基酸难于从天然产物中直接获得，虽可化学合成但路线复杂、高度污染、价格昂贵。为此利用酶生物转化工艺，即D-海因酶（D-Hydantoinase，HYD）和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶（D-Carbamoylase，CAB）两酶催化5’-单替代海因从而获得相应的D-氨基酸成为首选方法，该工艺路线具有特异性好、产物光学纯度高、无污染等优点，已成为目前工业生化领域的热点之一。我们将假单胞菌Pseudomonas putia YZ26中的HYD基因进行了随机突变、定点突变和截短突变，并对突变后的酶性质进行了一系列研究。又从中华根瘤菌Sinorhizobium sp．SS-ori中克隆了CAB基因，并将其插入到表达载体中，实现了在大肠杆菌宿主菌中可溶表达。同时，将这两个酶基因分别插入到了具有不同抗性的载体中，然后把两个重组质粒共转化到E.coli BL21（DE3）感受态细胞，得到了可以同时表达HYD和CAB的工程菌细胞。利用该工程菌转化5’-异丙基海因然后对产物进行了纯化，得到了具有一定光学纯度的D-缬氨酸。为生物转化工业创建了工程菌一步转化D-氨基酸的新工艺。1．HYD的突变酶分子定向进化实验流程包括突变体分子文库的建立以及其高通量筛选两个主要环节。我们在已构建表达工程菌株pE-hyd／E．coli BL21（DE3）的基础上，利用易错PCR技术使D-海因酶基因引入随机突变，经反复优化，将PCR条件确立为0.15mmol／L Mn²⁺+3mmol／L Mg²⁺、0.3mmol／L Mn²⁺+3mmol／L Mg²⁺、0.5mmol／LMn²⁺+2.5mmol／L Mg²⁺三个离子浓度梯度。将PCR扩增产物克隆到pET-3a载体，转化E.coli BL21（DE3），利用96孔板筛选了近1，000个克隆，最终获得较高活性的产酶菌株：pE-hyd₄₁／E．coli BL21（A）和pE-hyd₄₅／E．coli BL21（B）。以对羟基苯海因为底物，前者酶活性为初始重组菌株（pE-hyd／E．coli BL21（DE3））的2.7倍，为野生菌株Pseudomonas putia YZ26的20倍；若以海因为底物，则分别为1.4倍和15倍。后者以对羟基苯海因为底物，则分别为2.0倍和15倍。DNA序列分析表明，突变株A中海因酶基因为内源突变：即编码氨基酸序列第14位的谷氨酸（Glu）的密码子由GAA→GAG，第25位的天冬氨酸（Asp）的密码子由GAT→GAC，两个酸性氨基酸密码子的突变均为将生物合成过程中使用频率高的密码子变为使用频率低的密码子。而突变株B中产生一个残基突变，即Ala449Gly。SDS-PAGE分析表明pE-hyd₄₁／E．coli BL21（DE3）酶的表达量比初始重组菌株略有提高。将D-海因酶活性中心的239位的组氨酸残基分别突变为H239Y和H239L，316位的天冬氨酸残基突变为D316E，但突变株酶活性丧失殆尽；若将409位的组氨酸残基变为H409T，活力剩余40％。经（NH4）₂SO₄分级沉淀、Phenyl Sepharose疏水层析纯化，PAGE天然胶分析，突变酶仍然为二聚体，未发生解离现象；将410位的组氨酸残基变为H410A，活力基本丧失，仅剩余1.3％，表明相邻二个组氨酸在酶分子构象形成过程中所起的作用不同。分别将D-海因酶N-末端和C-末端的一个氨基酸残基剔除后得到突变酶HYDn1（N-末端Ser缺失）和HYDc1（C-末端Arg缺失）。经表达、纯化后，突变酶和完整酶（HYD）的SDS-PAGE、Native-PAGE和SEC分析表明，在完全相同的条件下，完整酶和突变酶的亚基分子量相同，但天然状态下完整酶为二聚体，而HYDc1为单体且剩余活力为完整酶的43％，HYDn1为二聚体和单体的混合物且活力完全丧失。CD分析结果显示，HYDc1同HYD相比没有发生明显改变，而HYDn1变化较大。HYD的pH稳定性显著增加，抗SDS能力亦有所提高，但热稳定性明显降低。结果预示：D-海因酶的C-末端残基Arg显著影响酶的分子形式及热稳定性，但非酶活性所必需；而其N-末端残基Ser既是酶的结构必需残基，也是其活性必需残基。2．CAB基因的克隆及表达从菌株Sinorhizobium sp．SS-ori中纯化的CAB的N-末端氨基酸序列设计了正向引物，并在已报道的不同来源菌株CAB的氨基酸序列同源性分析的基础上设计了简并反向引物。用该菌株总DNA为模板，经PCR扩增得到一长度约为0.9kb的片段，DNA测序表明其ORF为915bp。将CAB基因分别克窿到pUC18、pET3a、pET32M、pRSET、pGEX4T-2、pExSecI、pMAL-c2X等一系列表达载体中，然后在E.coli DH5α、E.coli 2426、E.coli BL21（DE3）中进行表达。但大多数表达产物为包涵体而不具酶活性。最终工程菌pMD／E．coli BL21（DE3）中获得CAB的可溶表达产物融合蛋白MBP-CAB（77 kDa），SDS-PAGE光密度扫描表明，其表达量约占菌体超声后离心上清总蛋白的20％。经Amylose亲和纯化和Superose 12凝胶排阻层析后达到了电泳纯。根据pMAL-c2X质粒背景，用Factor Xa剪切后，可得约42 kDa的MBP和35 kDa的CAB。酶活性检测表明，当用N-氨甲酰-DL-缬氨酸作为底物，以细胞浓度OD_600nm=10计，细胞活力为0.11U／ml．10OD_600nm。3．HYD和CAB的共表达虽然HYD和CAB均已在大肠杆菌中实现了可溶表达，但鉴于质粒的相溶性、抗性等因素，我们又将来自菌株YZ26的HYD基因插入到含有Kan抗性的pET-28a表达载体中，构建了重组质粒pET28a-hyd，将来自菌株SS-ori的CAB基因插入到含有Amp抗性的pQE30表达载体中，构建了重组质粒pQE30-cab。将这两个重组质粒共转化入E.coli BL21（DE3）感受态细胞，得到一菌两酶工程菌。对工程菌的表达条件进行了优化，利用Western blot对表达产物进行了鉴定。不同底物活性检测表明，底物侧链的疏水性对酶活性影响较大，工程菌不能转化侧链带有电荷的底物。4．D-缬氨酸的生产工艺利用上述构建好的一菌两酶工程菌对底物5’-异丙基海因转化生产D-缬氨酸，用1L菌体转化400ml 50mmol／L底物，在37℃反应42小时后底物的转化率达91.4％。反应液经离心，上清液用活性碳脱色，冷冻干燥后用乙醇漂洗等步骤得到了比旋光度为-19.4的产物D-缬氨酸。并进一步利用高效液相色谱、红外、核磁对产物进行了鉴定，结果显示各种谱图均和标准品相一致，表明其确为D-缬氨酸。5．D-对羟基苯海因及其酶解产物的HPLC分析采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）分析了工程菌pE-hyd／E．coli BL21（DE3）和天然菌SS-ori转化DL-对羟基苯海因的反应产物，探讨了流动相组份及其比例对分离的影响，结果表明流动相为50mmol／L的醋酸-醋酸钠缓冲液（pH4.2）和甲醇的混合溶液（体积配比为90：10）为最佳洗脱缓冲系统；采用C₁₈拄，在波长254nm检测条件下，有较好分离效果。底物DL-对羟基苯海因（DL-HPH）以及产物N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸（CpHPG）和产物D-对羟基苯甘氨酸（D-HPG）的质量浓度与峰面积呈良好的线性关系，相关系数在0.99以上。用HPLC法既可测定D-海因酶和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶的活性，又可对转化产物CpHPG和D-HPG进行定量分析。