【摘 要】
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目的本项目依据中医消渴症清热燥湿治法,结合现代医学对糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy,DR）的最新理论,关注DR发生发展过程中伴随的视网膜微血管炎症损伤和血管新生这两个主要病理环节。首先制备苦参总黄酮提取物,建立高糖诱导的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）体外损伤模型,观察苦参总黄酮对高糖诱导HUV
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目的本项目依据中医消渴症清热燥湿治法,结合现代医学对糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy,DR）的最新理论,关注DR发生发展过程中伴随的视网膜微血管炎症损伤和血管新生这两个主要病理环节。首先制备苦参总黄酮提取物,建立高糖诱导的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）体外损伤模型,观察苦参总黄酮对高糖诱导HUVEC损伤的影响,进而基于转基因斑马鱼模型考察苦参总黄酮对血管新生的抑制作用,并考察苦参总黄酮对链脲佐菌素（streptozocin,STZ）诱导的糖尿病（diabetes mellitus,DM）大鼠视网膜病变的作用,并分析其中相关信号通路、传导途径中潜在靶点的变化,试图从分子水平到整体系统阐明苦参总黄酮防治DR的作用及其机制,为苦参临床应用提供依据。方法1、建立高糖诱导HUVEC模型,采用CCK-8法、流式细胞技术考察不同浓度苦参总黄酮对细胞增殖及活性氧含量的影响;运用蛋白印迹法（Western Blot,WB）技术检测苦参总黄酮干预前后细胞内NF-κB、ICAM-1、VEGF及其受体表达情况。2、基于fli1-eGFP转基因斑马鱼模型,观察苦参总黄酮对斑马鱼胚胎的毒性并确定安全剂量范围;镜下观察结合图像分析不同浓度苦参总黄酮对斑马鱼体血管抑制情况;运用实时定量荧光PCR（Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）检测药物作用后斑马鱼胚胎VEGF,VEGFR-2,Ang-1、Ang-2,Tie-1、Tie-2等相关基因表达水平的变化。3、选用STZ诱导DM大鼠模型,观察连续给药4个月后大鼠存活率及饮食、尿量、体重变化;检查并比较各组大鼠空腹血糖、血液指标（PLT、PDW、MPV、PCT）、血液流变学指标、血脂四项、糖化血红蛋白（glycosylated hemoglobin,GHb）、糖化血清蛋白（glycosylated serum protein,GSP）、甘油三酯（Triglyceride,TG）、胆固醇（Cholesterol,CHO）指标情况;观察大鼠白内障情况;组织切片HE染色,观察给药后胰腺、视网膜病理形态学变化;免疫组织化学法检测视网膜中VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2、ICAM-1 蛋白表达情况;qRT-PCR、Western Blot 分别检测视网膜VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2、NF-κB、ICAM-1 mRNA水平及其蛋白表达变化情况。结果1、苦参总黄酮可抵抗高糖培养48h后HUVEC增殖抑制、胞内ROS含量增加状态,提高HUVEC细胞存活率（中、高组P＜0.05）、降低ROS含量（P＜0.05）;与模型组相比,苦参总黄酮干预后,细胞内VEGF、ICAM-1蛋白表达下降,VEGFR-2、NF-κB蛋白磷酸化水平降低,VEGFR-1蛋白磷酸化水平升高。2、与模型组相比,苦参总黄酮各剂量组均表现出明显的抑制fli1-eGFP斑马鱼血管新生作用（中、高组P＜0.05）,且在观察浓度范围内呈剂量依赖性;与模型组相比,各给药组给药后斑马鱼胚胎VEGFA、VEGFR-2、Ang-2、Tie-2 mRNA水平下降（P＜0.05）。3、苦参总黄酮可降低DM大鼠血糖、血脂、血液流变学异常水平,减轻胰腺、视网膜病理改变;免疫组化检测结果显示苦参总黄酮下调DM大鼠视网膜组织中VEGF、VEGFR-2、ICAM-1蛋白表达,上调VEGFR-1蛋白表达;qRT-PCR检测发现较模型组,给药组大鼠视网膜中VEGF、VEGFR-2、ICAM-1、NF-κB mRNA水平降低（P＜0.05）,VEGFR-1 mRNA水平升高（P＜0.05）;Western Blot检测结果显示:较模型组,给药组大鼠视网膜中VEGF、ICAM-1蛋白表达下降,VEGFR-2、NF-κB蛋白磷酸化水平降低,VEGFR-1蛋白磷酸化水平升高。结论1、实验结果提示苦参总黄酮可能通过抑制细胞氧化应激反应,抑制炎症反应中关键细胞因子NF-κB、ICAM-1的高表达,调控VEGF/VEGFR-2细胞信号通路,减少细胞损伤,改善细胞功能,从而发挥保护高糖损伤HUVEC的作用。2、苦参总黄酮具有抑制fli1-eGFP斑马鱼血管新生作用,并可能通过VEGF/VEGFR-2受体途径和Ang/Tie信号通路发挥抑制血管新生作用。3、苦参总黄酮能够改善DM大鼠的一般状况,减轻并改善视网膜的病理改变,延缓DR发生。结果提示苦参总黄酮抗DR的作用机制可能是通过抑制VEGF/VEGFR-2信号通路的激活,下调NF-κB和ICAM-1蛋白表达发挥作用,从而延缓、改善DR的病理改变,降低视网膜微血管炎症损伤和减少新生血管形成。
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