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分泌型磷脂酶A2（Secretory Phospholipase A2,sPLA2）是花生四烯酸（AA）代谢通路的上游关键酶，sPLA2的激活导致AA水平升高，进而产生更多的炎症介质，例如前列腺素、白三烯、血栓烷A等。因此，sPLA2的高表达可导致多种炎性疾病，例如胰腺炎、风湿性关节炎、肿瘤、动脉粥样硬化等，sPLA2也是以上多种疾病药物治疗的重要靶点。自然界中sPLA2在蛇毒中分泌最为广泛，蛇毒中毒患者也常有全身炎症反应综合症（SIRS）和组织坏死的症状。我们实验室前期从华游蛇（Sinonatrixannularis）——一种中国的无毒蛇中，分离到蛇毒sPLA2(svPLA2)的γ型抑制蛋白（phospholipae A2inhibitor, PLIγ）。前期研究中，我们发现这种PLIγ有良好的抗蛇毒PLA2出血毒作用。此外，与蛇毒PLA2与人sPLA2结构高度相似，分类上属于相同的亚型。因此，PLIγ能否阻断人类sPLA2，并可能对花生四烯酸（AA）介导的炎症发挥抑制作用，这个问题引起了我们的研究兴趣。鉴于此，我们克隆了PLIγ基因，并将其导入THP-1细胞中，评价PLIγ对LPS诱导的人THP-1细胞炎症的作用。目的：为了研究体内PLIγ在细胞水平的抗炎症作用，我们构建PLIγ重组表达载体并转染人THP-1细胞，检测细胞中sPLA2亚型，从而阐明其与炎症反应相关的sPLA2亚型，同时检测一些典型的促炎因子如AA、TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、PAF表达水平，通过LPS诱导的THP-1细胞，探讨PLIγ的抗炎活性。方法：设计分别含有EcoRI，BamHI酶切位点的上下游引物，通过RT-PCR克隆华游蛇PLIγ基因。PCR产物和pIRES2-EGFP载体经过酶切、凝胶回收和T4酶连接，构建pIRES2-EGFP-PLIγ重组表达载体，将其转化入DH5α菌保存，通过EcoRI，BamHI双酶切鉴定重组载体。重组载体通过脂质体法转染人THP-1细胞，于显微镜下观察GFP绿色荧光的表达，评价转染效率。由于转染效率较低，且重组质粒在THP-1细胞有丝分裂过程中容易丢失，因此，该质粒不适合后续的功能试验。为了保证PLIγ在THP-1的稳定表达，我们转而采用慢病毒载体系统。我们将PLIγ基因与含有3个Flag序列的标签融合表达，生成慢病毒载体PGC-FU-PLIγ-EGFP。将该重组病毒载体转染293T细胞，获得有感染能力的重组慢病毒LV-PLIγ-EGFP。重组蛋白PLIγ-3Flag的表达情况由western blot检测。将病毒LV-PLIγ-EGFP感染THP-1细胞，通过GFP荧光率评价感染效率。THP-1细胞分为三组：正常细胞组（control组）、PLIγ阴性组（该组仅转染LV-EGFP，也称mock组）、PLIγ阳性组（该组转染LV-PLIγ-EGFP，也称PLIγ组）。实验时，将1μg/ml LPS孵育各组THP-1细胞，同时设置与各组相对应的不加LPS的平行组。Real-time PCR方法检测各组细胞中sPLA2各亚型，采用ELISA法检测AA、TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、PAF等炎症因子表达水平，WST-1法研究各组THP-1细胞的增殖。结果：成功构建了pIRES2-EGFP-PLIγ的真核表达质粒，但由于该质粒的转染效率和稳定性都较低，不能满足后续功能试验要求。通过荧光显微镜观察和Western blot检测，本文构建的慢病毒系统能高效、稳定地表达GFP绿色荧光和PLIγ。在LPS诱导THP-1细胞炎症过程中，我们发现两种sPLA2亚型（IIF和X）及六种炎症因子表达显著上调。相对于正常组THP-1细胞，病毒转染组（PLIγ组和mock组）细胞炎症因子表达量更高。更重要的是，PLIγ组相对于mock组，其六种炎症因子的表达水平更低。WST-1实验发现，相对于正常组THP-1细胞，病毒转染组（PLIγ组和mock组）细胞增殖速度略慢，不过PLIγ组相对于mock组细胞增殖速度略快。结论:重组慢病毒系统可以稳定、高效地表达异源基因，如本文中的PLIγ基因。PLIγ的存在可以显著降低AA、TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、PAF等六种炎症因子表达。由于IIF和X型sPLA2在LPS诱导的THP-1细胞中表达上调，说明PLIγ很可能是通过抑制这两种sPLA2的激活而发挥抗炎症作用。此外，PLIγ不会影响细胞的增殖。