研究背景与目的肝细胞癌(HCC)是最常见的恶性肿瘤之一,HCC发病率在全球呈持续上升趋势,具有发病隐蔽、难治愈等特点,恶性程度高,确诊后的5年生存率不到10%,其癌症相关死亡率已高居世界第二。HCC的发病机制非常复杂,涉及了病毒感染、基因重组、炎症反应、细胞修复、分化再生等多种病理过程。目前的研究发现,HCC发生时,多种关键原癌基因(β连环蛋白、Axin1蛋白、PI-3-激酶、K-ras蛋白等)被活化,多种抑癌基因(p53、视网膜母细胞瘤基因(Rb1)、细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制剂2A(CDKN2A),胰岛素样生长因子2受体(IGF2R)、同源性磷酸酶-张力蛋白基因(PTEN)等被灭活,多条信号通路(WNT信号通路、MAPK信号通路、NF-κB信号通路等)发生异常。然而,HCC的发生发展是一个复杂的过程,迄今为止其具体分子机制仍未能完全阐明。目前,对肝癌最有效的治疗措施是手术切除。但由于肝细胞癌早期无明显的临床症状,以及早期诊断指标和方法的缺乏,大部分患者被确诊时已发展到晚期,错过了手术治疗的最佳时机,严重影响了患者的预后。因此,研究肝细胞癌发生发展的机制,找到新的诊断或治疗靶点对探索肝细胞癌的诊治新方法至关重要。乙肝病毒(HBV)的持续感染是导致肝细胞癌发生最主要的因素之一,大部分的HCC患者是由慢性乙肝发展而来。乙肝病毒基因组中的X基因编码的x蛋白(HBx)已被证实在HBV相关的HCC中发挥了多种促癌功能,比如促进细胞周期进程、使负性生长调节因子失活、调控细胞凋亡、抑制DNA核苷酸切除修复等。但上述HBx蛋白作用的具体分子机制尚未完全阐明。近年来的研究发现,除了蛋白质编码基因之外,还有一些非蛋白编码基因也参与了肿瘤的发生发展过程。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度大于200nt、缺少有效的开放阅读框或包含高密度终止子,不具备蛋白编码功能的转录本。目前的研究表明,lncRNA几乎参与了基因调控的各个层面,如:表观遗传调控、转录调控及转录后调控等。大多数lncRNA在组织分化发育过程中都具有时空表达特异性,其对疾病尤其是癌症中的作用正引起人们的广泛关注。与研究较成熟的microRNA(miRNA)相比,lncRNA在肝癌中的研究仍较少,即使发现了几种肝癌相关的lncRNA,但仍只是冰山一角,许多lncRNA的功能与分子调控机制仍不明确,因此我们有必要继续寻找与肝癌相关的特异性lncRNA,明确其功能,进一步挖掘lncRNA对肝癌影响的分子生物学机制。近期的一项研究发现槲皮素(quercetin)能下调HepG2细胞中IncRNA DBH-AS1的表达。槲皮素是一种针对多种癌症的天然预防药物,并被研究证实在肝细胞中具有抗增殖和抗氧化的作用。在Hsieh的研究中又发现槲皮素能有效抑制HBx相关的几种关键原癌基因。因此我们推测lncRNA DBH-AS 1可能在HBV相关性肝癌中具有一定的功能,而目前lncRNADBH-AS1对HBV相关性肝癌的影响和机制尚无报道。在我们的研究中,我们从临床、细胞水平及动物模型三个层面探讨DBH-AS1在HCC中的功能作用及其作用机制。本研究主要分为以下三个部分:第一部分 肝细胞癌临床组织样本中DBH-AS1含量与临床资料相关性研究一、实验目的明确DBH-AS1在肝细胞癌中的表达情况,通过临床资料分析初步推断其功能。二、实验方法收集45例临床肝细胞癌组织标本,并记录相应的临床资料。其中HBsAg阳性31例,阴性14例。采用Real-TimePCR检测DBH-AS1和HBx的表达情况,并通过SPSS13.0统计学软件分析DBH-AS1的表达水平与临床病理因素的联系,以此初步推断功能和机制研究的方向。三、实验结果Real-TimePCR结果显示,在45例肝细胞癌临床组织标本中,HBsAg阳性病人的肝癌组织中DBH-AS1的表达明显高于HBsAg阴性的病人(χ2=4.132,P=0.042),肿瘤较大的组织中DBH-AS1的表达比肿瘤较小的组织中DBH-AS1的表达量高(χ2=8.006,P=0.005),而DBH-AS1与其他临床资料均无显著关系。四、结论本研究首次发现lncRNADBH-AS1在肝癌组织中的表达与肿瘤大小呈正相关,并与HBV感染状态有关,且其与HBx的表达呈显著正相关。第二部分DBH-AS1的体外及体内的生物学功能研究一、实验目的明确DBH-AS1对肝细胞癌生物学行为的影响。二、实验方法1.采用Real-Time PCR方法来检测五种不同的肝细胞癌细胞系(SK-Hep1,HepG2,Hep3B,SMMC-7721,MHCC97H)和永生化的正常肝细胞系(LO2,QSG7701)中DBH-AS1的表达情况。根据检测结果选择DBH-AS1表达量较低的两种肝癌细胞系进行稳定过表达DBH-AS1细胞株的构建,选择DBH-AS 1表达量高的肝癌细胞系进行稳定干扰DBH-AS 1细胞株的构建。2.采用慢病毒感染方法构建稳定过表达或干扰DBH-AS1的细胞株,即过表达组和干扰组(LV-DBH-AS1/sh-DBH-AS1),以及对照组细胞株(NC)。病毒载体带有绿色荧光蛋白标签。采用Real-Time PCR验证感染后DBH-AS1的表达情况,结合感染后细胞绿色荧光蛋白的表达情况,并来评估病毒感染效率。3.采用EdU、CCK-8、平板克隆形成实验检测细胞增殖能力;流式细胞术(FCM)分析细胞周期;裸鼠皮下成瘤实验观察不同处理组的SMMC-7721细胞在裸鼠体内的成瘤和生长能力。三、实验结果1.Real-Time PCR结果显示,DBH-AS1在HCC细胞系中的表达量均高于正常肝细胞系。在HCC细胞系中,DBH-AS1在SK-Hep1和Hep3B中表达量较高,在SMMC-7721和HepG2细胞中表达量较低。2.采用LV-DBH-AS1 慢病毒感染HepG2、SMMC-7721 后,经Real-TimePCR验证,获得满意的过表达效果,得到稳定过表达DBH-AS1的HepG2、SMMC-7721过表达组细胞株。采用sh-DBH-AS1慢病毒稳定干扰Hep3B中DBH-AS1的表达,经Real-TimePCR验证,获得满意的干扰效果,得到稳定干扰DBH-AS1的Hep3B干扰组细胞株,阴性对照病毒感染HepG2、SMMC-7721、Hep3B细胞获得相应的对照组细胞株。3.EdU、CCK8、平板克隆形成实验显示,与对照组相比,过表达组的HepG2,SMMC-7721细胞的体外增殖能力明显增强。干扰组的Hep3B细胞的体外增殖能力明显降低。细胞周期检测结果提示过表达DBH-AS1后,可促进细胞周期从G1期向S期或G2期进展。裸鼠皮下成瘤实验表明过表达DBH-AS1后,可增强SMMC-7721细胞的体内成瘤能力和肿瘤的生长能力。四、结论体内和体外实验表明,DBH-AS1在肝细胞癌的生长和增殖中起着重要作用,其促增殖的作用有可能是通过促进细胞周期的进展实现的。第三部分DBH-AS1调控肝癌细胞增殖的分子机制研究一、实验目的明确DBH-AS1对肝细胞癌生长增殖的调控机制,及DBH-AS1的上游调控因子。二、实验方法1.采用Real-TimePCR检测DBH-AS1过表达组、干扰组与对照组细胞中的与细胞生长、增殖、周期等相关的重要基因的表达情况。2.Western-blot检测DBH-AS1过表达组、干扰组与对照组细胞MAPK通路重要支路蛋白(ERK、p38、JNK)的活化水平,及其下游蛋白表达情况。3.采用RNA干扰技术,干扰HepG2及L02细胞中TP53基因的表达,获得干扰组HepG2及L02细胞,阴性对照质粒(NC)转染HepG2及L02细胞获得相应对照组细胞。Real-Time PCR和Western-blot检测干扰组和对照组细胞中TP53基因及p53蛋白含量验证干扰效果。采用Real-Time PCR检测干扰TP53后DBH-AS1的变化情况。4.采用携带HBx表达基因的慢病毒载体(LV-HBx)及阴性对照病毒(LV-con感染HepG2及L02,构建稳定过表达HBx的HepG2及L02过表达组细胞株和相应的对照组细胞,Real-Time PCR和Western-blot检测过表达组和对照组细胞中HBx的表达情况,验证感染效率。Real-Time PCR检测HBx过表达组和对照组细胞中DBH-AS1的变化情况。三、实验结果1.Real-TimePCR结果显示:DBH-AS1过表达组HepG2细胞中的细胞周期正向调控因子CDK6、CCND1、CCNE1的mRNA水平上调,但细胞周期抑制蛋白p16、p21、p27的mRNA水平下调;在DBH-AS1干扰组Hep3B细胞中的CDK6、CCND1、CCNE1的mRNA水平下调,但细胞周期抑制蛋白p16、p21、p27的mRNA水平上调。2.Western-blot结果显示:DBH-AS1过表达组HepG2细胞中的CDK6、CCND1、CCNE1蛋白质水平上调,p16、p21、p27的蛋白水平下调,MAPK信号通路中重要蛋白磷酸化(p-ERK、p-p38、p-JNK)水平均增高;在Hep3B细胞中干扰DBH-AS1之后CDK6、CCND1、CCNE1蛋白水平下调,但细胞周期蛋白激酶抑制剂p16、p21、p27的蛋白水平上调,MAPK信号通路中磷酸化的关键蛋白(p-ERK、p-p38、p-JNK)水平均下调。3.干扰HepG2及L02细胞的TP53基因后,得到满意的p53mRNA下调效果,TP53干扰组较对照组细胞中的DBH-AS1的表达水平明显增高。4.经Real-Time PCR和Western-blot验证得到稳定过表达HBx的HepG2及L02细胞,HBx过表达组细胞较对照组细胞中的DBH-AS1的表达水平明显增高。四、结论DBH-AS1通过上调促增殖的相关基因,活化MAPK通路,调控细胞周期相关重要蛋白的表达水平,从而促进肝癌细胞增殖,且其本身在细胞中的含量受到p53蛋白的负调控,HBx蛋白可诱导DBH-AS1的表达。