背景与目的原发性肝癌是全球癌症相关死亡第三大主要原因,每年死亡病例约78万例,每年新增病例约84万例,发病率居全球恶性肿瘤第七位。在我国,原发性肝癌死亡率仅次于肺癌、胃癌,位居恶性肿瘤死因第三位。肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma,HCC）是原发性肝癌中最常见的组织学类型。尽管外科手术是HCC患者的主要治疗方法,但由于HCC早期症状较为隐匿,大多数患者在确诊时已处于疾病进展期,错过了理想的手术时间。对于无法手术切除的晚期HCC患者,姑息性化疗是主要的治疗策略。然而,由于耐药性的产生和较高的毒副作用,大多数常规化疗药物无法为HCC患者带来满意的治疗效果。因此,寻找一种减轻化疗毒副作用、提高机体免疫功能、改善患者生存质量、延长患者生存期的治疗方法,具有积极意义。天然产物由于其低副作用和广泛的抗癌生物活性为恶性肿瘤的治疗提供了新思路。从传统中草药两面针干燥根中提取的活性成分氯化两面针碱（nitidinechloride,NC）被证实在体内外能够抑制包括HCC在内的多种肿瘤的生长,是一个潜在的多靶点药物。但是,迄今为止,NC抗HCC的分子机制仍不明确。环状 RNA（circular RNA,circRNA）是一类没有 3’端 polyA 尾和 5’端帽结构的特殊转录本。与传统的线性RNA不同,circRNA是通过前体信使RNA反向剪接形成,在不同的物种间具有高度保守性。已有证据表明circRNA在HCC进展中发挥重要作用,提示其可以作为HCC治疗的潜在靶点。但circRNA能否作为NC抗HCC的靶点目前仍未知。本研究基于高通量测序技术筛选可能作为NC抑制HCC生长靶点的circRNA,并构建circRNA/miRNA/mRNA调控轴,探讨NC通过circRNA/miRNA/mRNA轴抑制HCC生长的作用及分子机制。方法采用Cell Counting Kit-8（CCK8）实验研究NC对HCC细胞活性的影响,计算NC作用48h后抑制50%HCC细胞生长的浓度（50%inhibitory concentration,IC50）,采用细胞流式实验研究NC对HCC细胞周期及凋亡的影响,采用细胞划痕实验研究NC对HCC细胞迁移的影响。应用高通量测序技术对3对NC处理和未处理HCC裸鼠移植瘤组织进行mRNA和circRNA测序分析。使用R软件包“DESeq2”获得在NC处理组和未处理组差异表达的mRNA和circRNA。使用R软件包“clusterProfiler”对NC处理后上调基因和下调基因分别进行基因本体论（Gene Ontology,GO）功能注释和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路分析。采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）实验验证差异表达的circRNA,筛选可能作为NC抑制HCC生长靶点的circRNA。通过RNase R实验确定circMBTPS2的成环性。通过荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）实验确定 circMBTPS2 在细胞中的定位。构建circMBTPS2过表达慢病毒转染进HCC细胞,采用CCK8实验、细胞流式实验、细胞划痕实验研究circRNA过表达对HCC细胞增殖、周期、凋亡、迁移的影响。在circMBTPS2过表达细胞中加入NC,通过CCK8实验和细胞划痕实验研究NC通过靶向circMBTPS2抑制HCC细胞增殖和迁移的作用。通过在线网站预测可以与circMBTPS2结合的miRNA以及miRNA靶基因,通过双荧光素酶报告实验验证circMBTPS2与miR-605-5p以及miR-605-5p 与 CHST11 的结合。RT-qPCR 检测 CHST11 在 circMBTPS2 过表达HCC细胞以及NC作用后的HCC细胞中的表达。收集基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）中的miRNA芯片数据集,计算标准均数差（standardmean deviation,SMD）和 95%可信区间（confidence interval,CI）,荟萃分析miR-605-5p在HCC组织和非癌肝组织中的表达差异。RT-qPCR检测CHST11 mRNA在20对HCC组织及癌旁组织中的表达。收集GEO 和医学癌症数据库（The Cancer Genome Atlas,TCGA）中的 mRNA 芯片和测序数据集,荟萃分析CHST11 mRNA在HCC中的表达情况及其区分HCC组织与非癌肝组织的能力,探讨CHST11 mRNA表达与HCC患者临床病理参数和预后的关系。通过免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）方法检测90对HCC和癌旁石蜡包埋组织中CHST11蛋白的表达,分析其表达与HCC临床病理参数的关系。构建CHST11干扰慢病毒转染进HCC细胞,采用CCK8实验、细胞流式实验、细胞划痕实验研究CHST11敲低对HCC细胞增殖、凋亡和迁移的影响。基于TCGA数据库和基因型组织表达数据库（The Genotype-Tissue Expression,GTEx）获得在 HCC 组织和正常肝组织中差异表达的基因,计算并获得与CHST11表达呈显著正相关或负相关的基因。使用R软件包“clusterProfiler”对CHST11相关基因进行GO功能注释和KEGG通路分析,使用gsea 3.0软件对得到的CHST11相关基因进行基因集富集分析（gene-set enrichment analysis,GSEA）。结果第一部分氯化两面针碱在体外对肝细胞癌细胞增殖、周期、凋亡、迁移的影响1.NC在体外能够抑制HCC细胞增殖活性。CCK8实验表明,NC在一定范围内能够显著抑制Huh7和Hep3B细胞增殖活性,且该抑制作用呈时间及浓度依赖性。NC作用Huh7细胞48h后的IC50值为5.096 ±1.186μmol/L,NC 作用 Hep3B 细胞 48h 后的 IC50 值为 5.767 ± 1.938μmol/L。2.NC在体外阻滞HCC细胞于S期及G2/M期。细胞周期实验表明,使用4μmol/L和8μmol/LNC作用于Huh7细胞24h,16μmol/L和32μmol/L NC作用于Hep3B细胞48h,相较于阴性对照组,NC组G1期细胞显著减少（P<0.05）,S期及G2/M期细胞显著增多（P<0.05）,且具有浓度依赖性。3.NC在体外诱导HCC细胞凋亡。细胞凋亡实验表明,使用4μmol/L和8μmol/L NC作用于Huh7细胞和Hep3B细胞48h后,NC组凋亡细胞比例较阴性对照组显著增加（P<0.05）,且具有浓度依赖性。4.NC在体外抑制HCC细胞迁移。细胞划痕实验表明,使用4μmol/L和8μmol/LNC作用于Huh7细胞和Hep3B细胞,相较于阴性对照组,NC组24h及48h细胞迁移率均显著下降（P<0.05）,且具有浓度依赖性。第二部分基于高通量测序技术筛选氯化两面针碱抗肝细胞癌潜在靶点1.NC作用前后HCC差异表达基因GO及KEGG富集分析。共获得851个在NC处理和未处理HCC裸鼠移植瘤组织中差异表达的基因,其中NC处理后上调基因370个,NC处理后下调基因481个。GO分析表明,上调基因在生物学过程（biologicalprogress,BP）中主要涉及细胞外基质组成,在细胞组分（cellularcomponent,CC）中主要定位于细胞外基质,在分子功能（molecularfunction,MF）中主要参与细胞外基质的组成,KEGG通路分析表明,上调基因主要富集在“Focal adhesion”（黏着斑）、“Protein digestion and absorption”（蛋白质消化吸收）、“PI3K-Akt signaling pathway”（PI3K-Akt 信号通路）、“ECM-receptor interaction”（ECM-受体相互作用）等信号通路。NC作用后下调基因在GO BP中主要涉及细胞间的粘附连接,GO CC中主要定位于细胞外基质,KEGG通路分析显示这些下调基因富集在“Hippo signaling pathway”（河马信号通路）、“ECM-receptor interaction”（ECM-受体相互作用）、“MAPK signalingpathway”（MAPK 信号通路）等信号通路。2.NC处理前后HCC差异表达circRNA验证。共获得290个在NC处理和未处理HCC裸鼠移植瘤组织中差异表达的circRNA,其中NC处理后上调circRNA 184个,NC处理后下调的circRNA 106个。RT-qPCR在3对NC处理和未处理HCC裸鼠移植瘤组织中验证发现circMBTPS2在NC作用后显著下调（P<0.05）,与高通量测序结果一致（log2（foldchange）=-1.0783,P=0.0079）。使用 2μmol/L 和 4μmol/LNC 作用于 Huh7 及 Hep3B 细胞 48h,构建NC作用HCC细胞模型,RT-qPCR证实NC能够在Huh7及Hep3B细胞中抑制circMBTPS2表达且具有浓度依赖性。第三部分氯化两面针碱通过靶向circMBTPS2抑制肝细胞癌生长研究1.CircMBTPS2的成环性验证及其在细胞中的定位。RNase R实验表明,circMBTPS2能够耐受RNase R消化。FISH实验表明circMBTPS2主要定位在细胞质。2.CircMBTPS2过表达对HCC细胞生物学行为的影响。CCK8实验表明,相较于阴性慢病毒转染组,circMBTPS2过表达组细胞活性增加（P<0.05）。细胞周期实验表明,相较于阴性慢病毒转染组,circMBTPS2过表达组G1期细胞比例显著增加（P<0.05）,S期细胞比例显著降低（P<0.05）。使用12μmol/LNC作用于Huh7细胞24h,使用32μmol/LNC作用于Hep3B细胞24h,细胞凋亡实验表明,circMBTPS2过表达组凋亡细胞比例较阴性慢病毒转染组显著降低（P<0.05）。细胞划痕实验表明,circMBTPS2过表达组24h及48h细胞迁移率均较阴性慢病毒转染组显著增加（P<0.05）。3.NC在体外抑制circMBTPS2过表达HCC细胞的增殖及迁移。CCK8实验表明,在一定浓度范围内,NC能够抑制circMBTPS2过表达HCC细胞的增殖活性,circMBTPS2过表达能缓解部分NC对HCC细胞增殖的抑制作用。细胞划痕实验表明,NC能够抑制circMBTPS2过表达HCC细胞的迁移,circMBTPS2过表达能缓解部分NC对HCC细胞迁移的抑制作用。第四部分CircMBTPS2通过结合miR-605-5p上调CHST11促进肝细胞癌生长研究1.CircMBTPS2/miR-605-5p/CHST11靶向结合关系预测及验证。CircInteractome数据库预测发现circMBTPS2与miR-605-5p存在结合位点,双荧光素酶报告实验证实二者可以靶向结合。TargetScan预测发现miR-605-5p与CHST11存在结合位点,双荧光素酶报告实验证实二者可以靶向结合。RT-qPCR证实在circMBTPS2过表达Huh7及Hep3B细胞中,CHST11表达较阴性对照组显著增加。在2μmol/L和4μmol/LNC作用后的Huh7及Hep3B细胞中,CHST11表达被显著抑制,且随着NC作用浓度的增加,NC对CHST11表达的抑制作用增强。2.基于GEO芯片数据分析miR-605-5p在HCC中表达。共纳入5个包含miR-605-5p表达的数据集,其中HCC组织样本329例,非癌肝组织样本131例,5个数据集的荟萃分析结果表明,miR-605-5p在HCC组织中的表达显著低于癌旁组织（SMD=-2.174,95%CI=-3.137～-1.211,P<0.0001）。3.CHST11 mRNA在HCC中的表达及临床意义。RT-qPCR表明CHST11 mRNA在HCC组织中较癌旁肝组织显著高表达。共纳入55个包含CHST11 mRNA表达的数据集,其中HCC组织样本2907例,非癌肝组织样本1839例,55个数据集的荟萃分析结果表明,CHST11 mRNA在HCC组织中的表达显著高于癌旁组织（SMD=0.31,95%CI=0.14～0.47,P<0.0001）,对CHST11 mRNA表达绘制总受试者工作特征（summary receiver operating characteristic,SROC）曲线,曲线下面积（area under the curve,AUC）为 0.75（95%CI=0.71～0.79）,敏感度为 0.51（95%CI=0.43～0.59）,特异度为0.87（95%CI=0.81～0.91）。CHST11 mRNA表达与年龄、性别、病理分级无关,与TNM分期有关,Ⅲ-Ⅳ期CHST11 mRNA表达水平显著高于Ⅰ-Ⅱ期（P=0.046）。单因素COX分析发现CHST11 mRNA高表达与HCC 患者较差的预后有关（hazard ratio（HR）=1.146,95%CI=1.031-1.274,P=0.012）,进一步的多因素COX分析发现CHST11 mRNA的表达是独立的预后因素（HR=1.122,95%CI=1.008-1.249,P=0.035）。4.CHST11蛋白在HCC中的表达及临床意义。IHC检测发现CHST11蛋白在HCC组织中较癌旁肝组织显著高表达（Z=67.901,P<0.0001）,对CHST11蛋白表达绘制的受试者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线的 AUC 值为 0.813（95%CI=0.749～0.877,P<0.0001）,敏感度为0.856,特异度为0.756。CHST11蛋白表达与年龄、性别、肿瘤大小、病理分级、巴塞罗那（Barcelona Clinic Liver Cancer,BCLC）分期、合并 HBV感染、合并肝硬化、微血管侵犯（microvascular invasion,MVI）等均无显著相关性。5.体外干扰CHST11对HCC细胞生物学行为的影响。CHST11干扰慢病毒（si-81566和si-81567）转染的Huh7和Hep3B细胞中CHST11的表达显着降低（P<0.05）。CCK8实验表明,相较于阴性慢病毒转染组,si-81566及si-81567组细胞增殖能力显著降低（P<0.05）。细胞凋亡实验表明,相较于阴性慢病毒转染组,si-81566及si-81567组细胞凋亡率显著增加（P<0.05）。细胞划痕实验表明,相较于阴性慢病毒转染组,si-81566及si-81567组24h和48h迁移率均显著降低（P<0.05）。6.HCC中CHST11相关基因功能分析。基于TCGA数据库和GTEx数据库共获得4251个在HCC组织和非癌肝组织中差异表达的基因,其中与CHST11表达显著相关的基因共有900个。GO功能注释及KEGG通路分析发现,900个CHST11相关基因主要参与调节“cell cycle”（细胞周期）,“cell adhesionmolecules（CAMs）”（细胞粘附分子）,“p53 signalingpathway”（p53信号通路）以及“PI3K-Akt signaling pathway”（PI3K-Akt信号通路）等生物学过程及信号通路。GSEA分析进一步表明,CHST11高表达可以正向调节细胞粘附相关通路,而CHST11低表达则对细胞生长起负向调节作用。结论1.NC具有显著的体外抗HCC作用,能在体外抑制HCC细胞增殖,阻滞HCC细胞于S期和G2/M期,促进HCC细胞凋亡,抑制HCC细胞迁移。2.NC可能通过调控黏着斑、PI3K-Akt信号通路、ECM-受体相互作用、MAPK信号通路等肿瘤相关信号通路发挥抑制HCC生长作用;circMBTPS2可能是NC抗HCC的潜在靶点。3.CircMBTPS2过表达在体外能够显著促进HCC细胞增殖、迁移,促进HCC进入G1期,抑制HCC细胞凋亡;NC能够抑制circMBTPS2过表达HCC细胞的增殖和迁移,circMBTPS2过表达能缓解部分NC对HCC细胞增殖及迁移的抑制作用,NC可能通过靶向circMBTPS2抑制HCC细胞增殖和迁移。4.CircMBTPS2可能通过结合miR-605-5p并促进其靶基因CHST11表达,从而促进HCC生长,NC可能通过靶向circMBTPS2/miR-605-5p/CHST11调控轴抑制HCC生长。