前言细胞周期是细胞生命活动的基本过程，其调控受到一系列调控因子的影响，而调控的正常与否对细胞的增殖、分化和肿瘤的发生、发展及形成过程中起重要的作用。P27^Kip1在细胞周期调控中的作用与肿瘤的关系更加受到研究者的关注。P27^Kip1是广谱的CDK抑制剂，对细胞周期起负性调节作用，参与细胞的凋亡和分化。As₂O₃用于治疗急性早幼粒细胞白血病的疗效已经得到认可，本次实验应用As₂O₃、TGF-β1单独或联合处理原代APL细胞，观察APL细胞的凋亡情况，研究了P27^Kip1、内源性TGF-β1和Cyclin E等在凋亡中的作用，从细胞、蛋白和基因水平探讨P27^Kip1在As₂O₃和TGF-β1诱导细胞凋亡过程中的作用，为进一步揭示砷剂治疗急性早幼粒细胞白血病（APL）的机制提供线索。实验材料方法1、药品与试剂淋巴细胞分离液购自中国协和医科学生物研究所；As₂O₃由哈尔滨伊达药业有限公司惠赠；RPMI1640培养基购自美国GIBCO公司；胎牛血清购自中国医学科学院工程研究所；TGF-β1购自Peprotech EC公司：PI染液购自美国sigma公司；Babbit Anti-P27^Kip1、Babbit Anti-TGF-β1、Babbit Anti-Cyclin E、BabbitAnti-bcl-2和SABC试剂盒购自博士德生物工程有限公司；DECP水、HPR-I、DL2000、rTaq、dNTP和MLV购自美国Promega公司；DAB显色试剂盒购自博士德生物工程有限公司；封片液购自军事医学科学院；PT-PCR所用引物由上海生工生物有限公司合成。2、研究对象2006年6月至2007年7月就诊于中国医科大学附属一院血液门诊病人，按FAB标准诊断为急性早幼粒细胞白血病（APL），病例组和正常对照组均取得了病人和／或家属的书面知情同意。3、原代APL细胞的分离和培养提取骨髓单个核细胞，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液调整细胞数至细胞浓度2×10⁶个／ml放入培养瓶中，37℃、5％CO₂、湿度98％条件下无菌培养。实验分为四组：对照组、5μmol/L As₂O₃处理组、5ng／ml TGF-β1处理组、5μmol／LAs₂O₃和5ng／ml TGF-β1联合处理组，分别于培养24小时、48小时和72小时收集细胞。4、细胞凋亡和细胞周期检测收集上述处理后的APL细胞，加入1ml碘化丙锭（PI）工作液，4℃避光染色40min后流式细胞仪进行测试。5、免疫组化SABC法检测P27^Kip1、内源性TGF-β1、Cyclin E和bcl-2蛋白表达情况收集APL细胞，制备细胞涂片。依次滴加兔抗人一抗、二抗、SABC工作液，显色，复染，封片，计数。6、RT-PCR检测P27^Kip1、内源性TGF-β1、Cyclin E和bcl-2的mRNA表达情况收集5-10×10⁶个APL细胞，Trizol液提取细胞总RNA，将RNA浓度调整为2μg／μl。逆转录反应体系共20μl（RNA 3μl、5XBuffer 4μl、dH₂O8μl、dNTP2μl、随机引物1．5μl、MLV 1μl、HPR-I 0．5μl），在PCR仪上以40℃，50min-99℃，3min条件下进行逆转录。扩增体系共25μl（cDNA 3μl、10xBuffer 2．5μl、dNTP 1．5μl、Taq DNA聚合酶0．2μl、dH₂O 15．8μl、上下游引物各1μl），B-actin作为内部对照，扩增所用引物及反应条件见表1。PCR产物电泳后于计算机分析条带密度，用产物的条带密度与β-actin的条带密度比值表示目的基因的相对表达水平。7、统计学方法数据以均数±标准差表示，采用SPSS 11．5统计软件进行析因分析，以P<0．05表示有显著差异。实验结果1、As₂O₃对APL细胞凋亡及细胞周期的影响（1）细胞凋亡的形态学改变不同浓度As₂O₃作用于原代APL细胞均可见细胞发生凋亡。随着As₂O₃浓度的增加，凋亡细胞所占比例增加。（2）不同浓度As₂O₃对APL细胞凋亡的影响流式细胞仪检测结果显示，As₂O₃在体外可明显诱导APL细胞发生凋亡。作用的同一时段，随着As₂O₃浓度的增加，APL细胞凋亡不断增加（P<0．05）。（3）不同作用时间的As₂O₃对APL细胞调亡的影响同一浓度As₂O₃作用于原代APL细胞，随着作用时间的延长，APL细胞凋亡也随之增加（P<0．05）。（4）As₂O₃对APL细胞周期的影响1μmol／L As₂O₃作用于APL细胞24小时，与对照组比较未见明显细胞周期阻滞；5μmol／L As₂O₃作用24小时，细胞周期阻滞于G1期（P<0．05），继续增加As₂O₃浓度至10μmol/L和15μmol／L作用24小时，细胞周期阻滞程度与5μmol/L时比较未见明显改变。1μmol/L、5μmol／L、10μmol／L As₂O₃作用于原代APL细胞48小时，细胞周期阻滞程度与上述同一浓度作用24小时比较无明显变化。2、TGF-β1对APL细胞凋亡及细胞周期的影响TGF-β1体外可明显诱导APL细胞发生凋亡，细胞周期阻滞于G1期。3、As₂O₃联合TGF-β1对原代APL细胞凋亡和细胞周期的影响5μmol/L As₂O₃联合5ng／ml TGF-β1作用于原代APL细胞，结果显示其可引起原代APL细胞发生明显凋亡（P<0．05），同时可见G1期细胞所占比例为94％，明显高于对照组（P<0．05）。4、As₂O₃和／或TGF-β1处理原代APL细胞P27^Kip1、内源性TGF-β1、Cyclin E、bcl-2表达变化情况（1）P27^Kip1蛋白与mRNA水平的变化As₂O₃作用于原代APL细胞后，P27^Kip1蛋白及mRNA水平表达均较对照组明显上调；TGF-β1处理原代APL细胞，P27^Kip1蛋白表达上调，但mRNA水平表达与对照组比较无明显变化；联合处理组P27^Kip1蛋白及mRNA水平表达上调程度强于As₂O₃处理组。As₂O₃、TGF-β1和联合处理组p27^Kip1蛋白表达与APL凋亡细胞数之间均存在正相关(r_As2O3=0．71、r_TGF-β1=0．52、r_{联合处理组}=0．34，P均<0．05)。（2）内源性TGF-β1蛋白与mRNA水平的变化As₂O₃处理原代APL细胞可见内源性TGF-β1蛋白和mRNA水平表达上调，外源性TGF-β1处理原代APL细胞可见内源性TGF-β1蛋白水平变化不明显，而mRNA水平表达上调；联合处理组内源性TGF-β1蛋白和mRNA与对照组比较表达上调。As₂O₃和联合处理组P27^Kip1蛋白表达与APL凋亡细胞数之间均存在正相关(r_As2O3=0．41、r_{联合处理组}=0．48，P均<0．05)。（3）Cyclin E蛋白与mRNA水平的变化As₂O₃、TGF-β1及联合处理组的APL细胞Cyclin E蛋白和mRNA表达与对照组比较均明显下调，三组之间无明显差。（4）bcl-2蛋白与mRNA水平的变化As₂O₃、TGF-β1及联合处理组的APL细胞bcl-2蛋白和mRNA水平表达与对照组比较均明显下调，且以联合处理组下调更为明显。结论1、As₂O₃和TGF-β1单独或联合作用均可诱导原代APL细胞发生凋亡，且联合处理组原代APL细胞凋亡程度明显强于单剂处理组。2、As₂O₃处理原代APL细胞后可见P27^Kip1、内源性TGF-β1蛋白和mRNA表达上调；外源性TGF-β1处理后，P27^Kip1蛋白表达上调，而mRNA变化不明显；联合处理组P27^Kip1蛋白和mRNA表达上调程度强于单剂处理组。3、As₂O₃诱导原代APL细胞发生凋亡的机制是通过上调内源性TGF-β1，从而使P27^Kip1表达上调，拮抗Cyclin E和bcl-2的作用，使细胞周期阻滞于G1期，细胞发生凋亡。外源性TGF-β1通过上调内源性TGF-β1的表达，增强了As₂O₃诱导原代APL细胞凋亡的作用。