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目的观察四组高数量细胞团无支架离心管内聚集共培养与非共培养体系生成软骨组织的大小和生物学特点,并对无支架离心管共培养技术进行评价,为临床上关节软骨缺损修复中无支架组织工程软骨的构建方法提供新的思路。方法新西兰大耳白兔的长骨骨髓腔冲洗获取骨髓液,密度梯度离心法分离、培养骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),传至3代后获得纯化的BMSCs。分离兔膝关节软骨,通过胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶消化获取较纯的原代软骨细胞(Articular Chontrocytes,ACs),传代培养。利用阿利新蓝染色、蕃红花“O”-亮绿染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色对ACs进行鉴定。利用免疫荧光法鉴定BMSCs的表面分子标志CD34、CD44、CD45和CD105。实验分为四个组,ACs和BMSCs分别按1:3和2:2的比例混合共培养二个组,1500r/min离心5分钟,聚集共培养于15ml离心管内,一个离心管内细胞总数为4×10~7。另取等量软骨细胞为AC组,等量BMSCs向ACs诱导转化的BMSCs诱导组(加入TGF-β1等的软骨诱导液),以上述方法培养于离心管内作对比研究。四组高数量细胞团分别培养1周、2周、3周、4周后制成石蜡组织切片,脱蜡后进行阿利新蓝染色、蕃红花“O”-亮绿染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色。HE染色观察体外培养条件下每组生成软骨组织的形态结构。采用阿利新蓝比色法定量检测培养上清液糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAG)含量,酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)定量检测上清液Ⅱ型胶原含量。结果ACs阿利新蓝、蕃红花“O”-亮绿及Ⅱ型胶原免疫组化染色均阳性,BMSCs免疫荧光染色CD34(-)、CD44(+)、CD45(-)、CD105(+);单纯AC组、2:2共培养组和1:3共培养组阿利新蓝、蕃红花“O”-亮绿及Ⅱ型胶原免疫组化染色均阳性,BMSCs诱导组三个染色弱阳性。HE染色可见一、二、三周AC组和1:3共培养组软骨细胞逐渐融合,在第四周时局部有融合成初期软骨组织。2:2共培养组和BMSCs诱导组细胞在一、二、三、四周也逐渐融合,但四周后未见初期软骨组织形成。一周后AC组GAG含量(61.68±32.62ug/ml)与2:2共培养组(34.82±17.06ug/ml)和1:3共培养组(42.86±23.69ug/ml)相比较,差异无统计学意义(F=1.170,p>0.05);二周后AC组GAG含量(96.70±44.56ug/ml)与2:2共培养组(107.05±44.56ug/ml)和1:3共培养组(92.83±26.71ug/ml)相比较,差异无统计学意义(F=2.197,p>0.05);三周后AC组GAG含量(157.19±48.07ug/ml)与2:2共培养组(132.75±19.56ug/ml)和1:3共培养组(121.01±29.92ug/ml)相比较,差异无统计学意义(F=0.352,p>0.05);四周后AC组GAG含量(179.43±59.19ug/ml)与2:2共培养组(158.06±23.77ug/ml)和1:3共培养组(160.06±30.58ug/ml)相比较,差异无统计学意义(F=0.210,p>0.05)。一周后AC组GAG含量(61.68±32.62 ug/ml)与BMSCs诱导组(10.71±6.12ug/ml)比较,差异有统计学意义(t=3.697,p<0.05);二周后AC组GAG含量(96.70±44.56ug/ml)与BMSCs诱导组(25.29±14.41ug/ml)比较,差异有统计学意义(t=3.765,p<0.05);三周后AC组GAG含量(157.19±48.07 ug/ml)与BMSCs诱导组(56.14±43.67ug/ml)比较,差异有统计学意义(t=4.209,p<0.05);四周后AC组GAG含量(179.43±59.19 ug/ml)与BMSCs诱导组(70.74±40.17ug/ml)比较,差异有统计学意义(t=3.980,p<0.05)。一周后AC组Ⅱ型胶原含量(130.68±27.19ng/ml)与2:2共培养组(101.05±19.91ng/ml)和1:3共培养组(77.16±29.01ng/ml)相比较,差异有统计学意义(F=22.106,p<0.05);二周后AC组Ⅱ型胶原含量(145.51±40.37ng/ml)与2:2共培养组(127.80±31.72ng/ml)和1:3共培养组(101.13±24.43ng/ml)相比较,差异无统计学意义(F=1.443,p>0.05);三周后AC组Ⅱ型胶原含量(162.19±38.07ng/ml)与2:2共培养组(152.25±28.23ng/ml)和1:3共培养组(133.91±32.29ng/ml)相比较,差异无统计学意义(F=2.241,p>0.05);四周后AC组Ⅱ型胶原含量(185.13±35.96ng/ml)与2:2共培养组(169.72±32.56ng/ml)和1:3共培养组(148.91±33.16ng/ml)相比较,差异无统计学意义(F=0.680,p>0.05)。一周后AC组Ⅱ型胶原含量(130.68±27.19ng/ml)与BMSCs诱导组(52.36±5.37ng/ml)比较,差异有统计学意义(t=7.859,p<0.05);二周后AC组Ⅱ型胶原含量(145.51±40.37ng/ml)与BMSCs诱导组(69.25±13.98ng/ml)比较,差异有统计学意义(t=4.610,p<0.05);三周后AC组Ⅱ型胶原含量(162.19±38.07ng/ml)与BMSCs诱导组(90.49±39.90ng/ml)比较,差异有统计学意义(t=3.503,p<0.05);四周后AC组Ⅱ型胶原含量(185.13±35.96ng/ml)与BMSCs诱导组(116.83±40.17ng/ml)比较,差异有统计学意义(t=3.434,p<0.05)。结论BMSCs和ACs通过离心管内聚集共培养可诱导BMSCs分化为ACs,具有ACs的生物学特点。单纯AC组与1:3共培养组四周后HE染色下局部可见有初期软骨组织;BMSCs诱导组和2:2共培养组未形成初期软骨组织。