海南地不容(Stephania hainanensis H.S.Lo et Y.Tsoong)为防己科千金藤属植物,是海南代表性南药黎药。已有研究表明海南地不容的主要活性成分为生物碱,为深入探索其化学成分组成,本课题首先采用醇提法结合各种分离手段分离得到多个单体化合物,并利用理化性质鉴定及波谱分析方法对得到的单体化合物进行结构鉴定。为进一步探讨海南地不容中发挥抗炎作用的活性成分,本课题选取海南地不容中12种生物碱成分,采用LPS诱导RAW 264.7小鼠巨噬细胞建立经典炎症模型,进行抗炎活性筛选。继而通过NO试剂盒检测被筛选出的化合物对LPS诱导RAW 264.7细胞的NO释放量的影响,利用Q-PCR法检测该化合物对LPS诱导RAW 264.7细胞中TNF-α、COX-2表达的影响,同时检验该化合物对体外自由基的清除能力。最后,本课题通过建立同时测定海南地不容中多种生物碱含量的UPLC-MS-MS分析方法,探讨海南地不容中活性成分的含量。本文采用 Waters Acquity UPLC HSS T3 色谱柱(2.1 mm ×100 mm,1.7 μm),0.1%甲酸(A)-乙腈(B)作为流动相进行梯度洗脱(0-1 min,18%B;1-7 min,18%-28%B;7-9 min,28%-59%B;9-18 min,59%-100%B),流速 0.3 mL/min,进样量 1 μL;质谱条件采用多反应离子监测扫描模式(MRM),优化三重四级杆质谱仪参数和6种指标性成分的质谱参数进行检测。数据处理均采用独立样本t检验。通过各种提取分离方法,最终从海南地不容中得到19个单体化合物,并经理化性质鉴定及波谱分析方法确定了该19个单体化合物分别为:荷包牡丹碱(Dicentrine,1)、克班宁(Crebanine,2)、去甲基荷包牡丹碱(Demethydicentrine,3)、去甲基克班宁(Demethycrebanine,4)、氧化克班宁(Oxocrebanine,5)、4-O 荷包牡丹碱(4-Oxodicentrine,6)、巴婆碱(Asimilobine,7)、对羟基苯乙醇葡萄糖苷(p-Hydroxy-phenethylalcohol,8)、四氢小檗碱(Tetrahydropalerine,9)、千金藤素(Cepharanthine,10)、盐酸巴马汀(Palmatine hydrochloride,11)、延胡索乙素(Tetrahydropalmatine,12)、粉防己碱(Tetrandrine,13)、防己诺林碱(Fangchinoline,14)、白屈菜红碱(Chelerythrine,15)、木兰花碱(Magnoflorine,16)、蝙蝠葛碱(Dauricine,17)、盐酸小檗胺(Berbamine hydrochloride,18)、盐酸青藤碱(Sinomenine hydrochloride,19)。其中化合物2-9、15-19首次从海南地不容中分离得到,化合物3、4、6首次从千金藤属植物中分离得到。通过抗炎活性筛选实验发现四氢小檗碱(THB)具有较好的抗炎效果,因此选择THB进行后续研究。结果表明THB(5μg/mL,10 μg/mL,20 μg/mL)可显著地抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞中NO的产生,并显著地抑制TNF-α、COX-2 mRNA水平的表达;此外,THB也表现出一定的体外自由基清除作用。因此得出结论,THB具有抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症反应的作用,推测其抗炎机制可能与抑制TNF-α、COX-2的表达有关。通过UPLC-MS-MS分析方法表明,在一定浓度范围内,四氢小檗碱、千金藤素、防己诺林碱、粉防己碱、木兰花碱及蝙蝠葛碱6种生物碱成分的线性关系良好(R2>0.999);精密度试验RSD在0.41%-2.13%范围内,重复性试验RSD在0.77%-1.40%范围内,稳定性试验RSD在0.89%-1.99%范围内,平均加样回收率在99.61%-104.55%范围内,RSD≤2.07%,通过该方法测得海南地不容中四氢小檗碱、千金藤素、防己诺林碱、粉防己碱、木兰花碱及蝙蝠葛碱6种生物碱的平均含量分别为1.647、0.05815、7.913、0.4043、424.5、0.4993 μg/g。因此,该含量测定方法灵敏度高、稳定可靠、重复性良好,为测定海南地不容中生物碱成分的含量提供一定的理论依据。