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研究背景:甲醛（formaldehyde,FA）是一种常见的环境污染物,可引起呼吸系统损伤等一系列健康损害。上皮-间质转化（Epithelial–mesenchymal transition,EMT）在肺部发育和多种肺部疾病的发生发展中起重要作用。硫化氢（Hydrogen Sulfide,H2S）是公认的气体信号分子之一,参与广泛的细胞功能和各种疾病的生理和病理过程,在多种肺部疾病中发挥着重要的治疗作用。本课题组前期研究显示,硫化氢参与调控百草枯或氯化镍诱导的肺上皮-间质转化。然而甲醛能否导致肺上皮-间质转化,以及硫化氢在甲醛所诱导的肺上皮-间质转化中的作用及机制尚不明确。研究目的:本研究以肺支气管上皮细胞系（BEAS-2B）为模型,通过体外实验探讨外源性硫化氢供体硫氢化钠（Sodium hydrosulfide hydrate,Na HS）在甲醛诱导的肺上皮-间质转化中的作用及机制,对阐明甲醛诱导肺损伤机制具有重要意义,同时也将为治疗甲醛所致肺损伤提供新的思路。研究方法:采用生长状态良好的BEAS-2B细胞进行处理,分别进行以下实验:1.为验证甲醛是否通过激活TGF-β/Smads和MAPKs信号通路诱导肺上皮-间质转化,对BEAS-2B细胞进行甲醛不同时间（100μM-0,6,12,24,36h）、不同剂量（0,25,50,75,100μM-24h）处理,或使用TGF-β和MAPKs抑制剂预处理细胞后进行甲醛短期染毒（100μM,24h）;使用相差显微镜观察细胞形态并拍照记录,采用Western Blot实验检测BEAS-2B细胞内上皮、间质标志蛋白及TGF-β/Smads和MAPKs信号通路蛋白表达水平。2.为探讨硫化氢在甲醛诱导的肺上皮-间质转化中的作用,BEAS-2B细胞经甲醛不同时间（100μM-0,6,12,24,36h）、不同剂量（0,25,50,75,100μM-24h）处理后,采用化学荧光法检测细胞内H2S含量;通过Western Blot实验检测CBS、CSE、3-MST三种H2S合成酶的蛋白表达水平。为探讨硫化氢是否通过TGF-β/Smads和MAPKs信号通路抑制甲醛所致肺上皮-间质转化,使用Na HS预处理BEAS-2B细胞后进行甲醛短期染毒（100μM,24h）,通过相差显微镜观察细胞形态变化,采用Western Blot实验检测上皮、间质标志蛋白及TGF-β/Smads和MAPKs信号通路蛋白表达水平。3.为探讨硫化氢是否通过调控NRF2-ROS途径抑制TGF-β/Smads和MAPKs信号通路从而逆转甲醛所致肺上皮-间质转化,使用Na HS（100μM）或NAC（1m M）预处理BEAS-2B细胞后再进行甲醛短期染毒（100μM,24h）。通过化学荧光法检测细胞内总ROS水平;通过Western Blot法检测细胞内NRF2总蛋白、胞浆胞核蛋白及TGF-β/MAPKs信号通路蛋白表达。研究结果:1.甲醛暴露诱导肺支气管上皮细胞（BEAS-2B）发生形态改变（细胞由铺路石状逐渐变长成为梭形,细胞间隙变大）;细胞内上皮标志物E-cadherin蛋白表达水平下调,间质标志物N-cadherin、vimentin、ɑ-SMA及转录因子zeb-1蛋白表达水平上调,均呈现明显的时间-效应关系,同对照组比差异有统计学意义（P＜0.05）。2.甲醛暴露通过激活TGF-β/Smads和MAPKs信号通路诱导肺上皮-间质转化:对BEAS-2B细胞进行不同时间（100μM-0,6,12,24,36h）、不同剂量（0,25,50,75,100μM-24h）甲醛染毒处理后,同对照组相比,BEAS-2B细胞内TGF-β、p-Smad2、p-Smad3、p-ERK、p-JNK和p-P38蛋白表达水平呈时间、剂量依赖性上调。使用TGF-β和MAPKs抑制剂预处理后再进行甲醛短期染毒（100μM,24h）,同FA暴露组比,TGF-β/MAPKs抑制剂+FA组细胞内TGF-β、p-ERK、p-JNK、p-P38蛋白表达水平下调,同时上皮标志E-cadherin蛋白表达水平上调、间质标志N-cadherin、vimentin蛋白表达水平下调,差异有统计学意义（P＜0.05）。3.甲醛诱导BEAS-2B细胞内硫化氢水平降低、硫化氢合成酶（CBS、CSE、3-MST）蛋白水平下调:经不同时间（100μM-0,6,12,24,36h）、不同剂量（0,25,50,75,100μM-24h）甲醛染毒处理后BEAS-2B细胞内源性硫化氢水平降低,CBS、CSE、3-MST蛋白表达水平减少,均呈明显的时间-剂量效应关系,差异有统计学意义（P＜0.05）。4.硫氢化钠可恢复甲醛诱导的硫化氢水平减少和肺上皮-间质转化:Na HS预处理后进行甲醛短期染毒（100μM,24h）,同FA暴露组比,Na HS+FA组细胞内硫化氢水平升高,肺支气管上皮细胞（BEAS-2B）形态恢复,E-cadherin蛋白表达上调,N-cadherin、vimentin、ɑ-SMA及zeb-1（转录因子）蛋白表达水平下调,差异有统计学意义（P＜0.05）。5.硫氢化钠可抑制甲醛激活的TGF-β/Smads和MAPKs信号通路:Na HS预处理后进行甲醛短期染毒（100μM,24h）,同FA暴露组比,TGF-β/MAPKs抑制剂+FA组,BEAS-2B细胞内TGF-β、p-Smad2、p-Smad3、p-ERK、p-JNK和p-P38蛋白表达水平减少,差异有统计学意义（P＜0.05）。6.硫氢化钠可恢复甲醛诱导的细胞内NRF2总蛋白、胞浆蛋白及胞核蛋白表达水平下调:经不同时间（100μM-0,6,12,24,36h）、不同剂量（0,25,50,75,100μM-24h）甲醛染毒处理,BEAS-2B细胞内NRF2总蛋白、胞浆蛋白及胞核蛋白表达水平呈时间、剂量依赖性降低,提示甲醛暴露可诱导BEAS-2B细胞内核转录因子NRF2蛋白表达水平下调。使用Na HS预处理后再进行FA（100μM,24h）染毒,相比于FA组,FA+Na HS组BEAS-2B细胞内NRF2总蛋白、胞浆蛋白及胞核蛋白表达水平上调,差异有统计学意义（P＜0.05）。7.硫氢化钠可恢复甲醛诱导的总活性氧水平升高:经不同时间（100μM-0,6,12,24,36h）、不同剂量（0,25,50,75,100μM-24h）甲醛染毒处理,BEAS-2B细胞内总ROS水平呈时间、剂量依赖性升高。使用Na HS（100μM）预处理FA（100μM,24h）染毒的BEAS-2B细胞,FA+Na HS组相比于FA组,BEAS-2B细胞内总ROS水平降低。8.NAC可通过抑制TGF-β/MAPKs信号通路改善甲醛诱导的肺上皮-间质转化:NAC预处理后进行甲醛短期染毒（100μM,24h）,同FA暴露组比,NAC+FA组肺支气管上皮细胞（BEAS-2B）形态恢复,E-cadherin蛋白表达水平增多,N-cadherin、vimentin蛋白表达水平减少,TGF-β、p-Smad2、p-Smad3、p-ERK、p-JNK和p-P38蛋白表达水平减少,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论:1.甲醛通过激活TGF-β/Smads和MAPKs通路诱导肺上皮-间质转化。2.甲醛降低细胞内源性硫化氢水平,抑制硫化氢合成酶的蛋白表达水平;外源性硫化氢供体硫氢化钠通过补充细胞内硫化氢,抑制甲醛激活的TGF-β/Smads和MAPKs通路,进而逆转肺上皮-间质转化。3.硫氢化钠可能通过上调NRF2蛋白表达水平来抑制活性氧的生成,进而抑制TGF-β/Smads和MAPKs信号通路的激活,从而逆转甲醛诱导的肺上皮-间质转化。