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高酮血症(Hyperketonemia,HYK)是奶牛产后常见的一种临床病理学表现,它与泌乳早期的生产性能下降和很多疾病相关,评价和研究其诊断方法非常必要。本研究试图建立血浆β-羟丁酸(BHBA)酶循环微量检测法,并同时评价该方法与传统的水杨醛比色法的检出率和可靠性。此外,利用上述两方法中的较为可靠和实用的方法作为HYK检测方法调查南宁市某奶牛场的HYK发病率,分析HYK病因以及HYK是否与泌乳早期疾病和产奶量下降有关。实验一:血浆BHBA酶循环微量检测法的建立,我们在BHBA酶循环微量检测法文献及专利基础上,摸索奶牛血浆BHBA酶循环微量检测法,并评价该方法的精密度(CV%)、准确度(偏差、干扰)和线性范围(检测范围)。通过重复测定高低两组不同浓度血浆BHBA,结果低浓度组(均值为0.7941 mmol/L)总CV%和批间CV%分别为5.53%和5.03%,高浓度组(均值为2.0524 mmol/L)总CV%和批间CV%分别为5.81%和4.94%。使用南京建成BHBA试剂盒作为对比方法同时检测143份不同浓度BHBA奶牛血浆(其中39份BHBA ≥ 1.2mmol/L),两方法检测结果极显著相关(R2=0.9967,P<0.01),两方法偏差为0.149(95%CI=-0.296～0.594)。使用HYK阈值(BHBA≥ 1.2 mmol/L)时本法敏感性和特异性分别为97.06%和95.41%。干扰试验中分别加入5个干扰物甘油三脂、胆红素、葡萄糖、尿酸、血红蛋白,结果发现干扰最大的物质为浓度1200 mg/dL的甘油三酯,干扰率为5.33%其他干扰物的干扰率均小于5%,对BHBA酶循环微量检测法干扰较小。线性试验测定从0～5 mmol/L的5个不同浓度样本每个浓度平行测定4次,线性相关系数(R2)为0.9987。空白检测限试验用蒸馏水作为样本检测20次换算为浓度,得出空白检测限为0.1199 mmol/L。实验二:水杨醛比色法的方法评价:取低、中、高3个不同浓度梯度的血浆混合物(酮体≤0.34mmol/L,0.34mmol/L<酮体<0.50 mmol/L中浓度组,酮体≥0.70mmol/L),进行精密度评价,每天测定两次,每次样本都平行测定2次,结果发现高、中浓度组CV%均小于5%,低浓度组CV%在10%以内。回收试验时在相同血浆样本加入不同浓度丙酮,结果血浆酮体在0.52～2.58 mmol/L范围内时,酮体的回收率在97.33%～102.49%之间。线性试验得出水杨醛法在0～2.75 mmol/L时R2 = 0.9934。使用南京建成BHBA试剂盒作为标准比对方法,试剂盒检测结果BHBA≥1.2 mmol/L时,ROC曲线得出水杨醛比色法酮病诊断的最佳阈值为酮体≥0.5 mmol/L,此时水杨醛法的敏感性为95.45%,特异性为95.47%;两方法同时检测614份血浆,检测结果极显著相关(r=0.714,P<0.001)。实验三:2017年9月到2018年12月期间在南宁市某奶牛场进行流行病学调查,对386头产后1-6周内奶牛进行HYK检测。从牛场获取胎次、胎衣不下、产奶量、子宫炎、真胃左移等数据,记录产犊当日BCS(体况评分),每周一次采集产后1-6周试验牛血浆,使用BHBA酶循环微量检测法检测BHBA浓度,BHBA ≥ 1.2 mmol/L为HYK 阳性,BHBA<1.2 mmol/L为阴性结果,试验期间发现有65头奶牛至少出现一次HYK阳性结果,该牛场HYK发病率为16.8%。使用巢氏病例对照研究胎衣不下、胎次和BCS是否与造成HYK发病有关,研究HYK发生真胃左移、子宫炎和产奶量下降是否有关。结果发现胎衣不下、胎次≥ 3、BCS ≥ 3.5或BCS≤2.5的奶牛HYK发病风险的奶牛高于未暴露在这些风险因素下的奶牛;HYK发生真胃左移风险是NHYK奶牛的1.65倍(χ2 = 1.1,P<0.05),产奶量下降风险是NHYK牛的1.656倍(χ2=29.27,P<0.001),HYK牛发生子宫炎与NHYK差异不显著(P=0.072)。结论:1.BHBA酶循环微量检测法准确度精密度极好与商用BI-HBA试剂盒对比检测结果偏差小;2.水杨醛比色法精密度准确度良好,与商用BHBA试剂盒对比检测结果相关性强;3.选择BHBA酶循环微量检测法作为流行病学调查方法,该牛场HYK一年的发病率为16.8%,产后胎衣不下、BCS不均衡、胎次增加均为奶牛HYK风险因素,奶牛HYK可诱发真胃左移、产奶量下降,与子宫炎关系不显著。