阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种在老年期常见的神经退行性疾病，主要临床表现为进行性记忆、认知功能减退和精神障碍。AD的主要病理特征是在基底前脑、海马和大脑皮层部位细胞外的老年斑（senile plaques，SP）和细胞内神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFT），并伴有突触和神经元的缺失。 Β-淀粉样蛋白（β-amyloid protein, Aβ）是构成AD特征性病理改变老年斑的核心成分。大量研究证实Aβ尤其是聚合成纤维形式的Aβ对体外培养的神经细胞及在体神经细胞有毒性作用，主要毒性片段为Aβ25-35，表现在破坏细胞膜的完整性、扰乱细胞内环境的稳定以及触发氧化应激、诱导细胞发生凋亡等方面。神经病理学研究表明，AD患者脑中神经元的凋亡率比正常人高30-50倍，细胞凋亡在AD发病中具有重要作用，是AD神经元丧失的原因之一。因此，探求可以有效对抗Aβ25-35神经毒性的药物对于AD的治疗是非常必须的。 姜黄素（Curcumin）是从姜黄中提取得到的主要有效成分，一直作为食品添加剂为人们所普遍利用。大量研究发现姜黄素具有抗氧化、抗炎、免疫调节、抗肿瘤等生理和药理作用。近年来，姜黄素对于AD的研究越来越受到人们的关注，但具体机制尚不明确。 本课题在此基础上建立Aβ25-35诱导PC12细胞损伤模型，同时应用姜黄素对其进行干预，观察其拮抗Aβ25-35的毒性的保护作用及其可能的机制。 本课题分两部分。 第一部分：研究Aβ25-35对PC12细胞的神经毒性作用。 选用Aβ25-35 诱导的PC12细胞作为AD的细胞模型，四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定不同浓度Aβ25-35对PC12细胞活力的影响，应用Annexin V-PI染色通过流式细胞仪、荧光显微镜检测细胞凋亡。结果发现，显微镜下观察正常对照组PC12细胞体积较大，神经突起明显且长，细胞生长快，密度大，细胞贴壁能力强。加入Aβ25-35 24h后，细胞数量减少，体积变小，突起减少变短，细胞贴壁能力减弱，随着Aβ25-35剂量的加大，细胞明显变小变圆，突起渐消失。MTT活性测定显示随着Aβ25-35浓度的增加，细胞活性逐渐下降，在Aβ25-35为20μmol/L时细胞活力开始明显下降（P<0.01），随着剂量逐渐加大，细胞活性进一步降低，呈剂量依赖，各浓度组之间均有统计学显著性差异（P<0.05）。Annexin-V/PI染色后荧光显微镜观察到Aβ25-35处理过的PC12细胞出现典型的细胞凋亡征象，早期的凋亡细胞只出现细胞膜染色而细胞核未被染色，晚期的凋亡细胞则细胞膜和细胞核同时染色。 第二部分：姜黄素拮抗Aβ25-35对PC12细胞的毒性作用及其可能的机制。 选用PC12细胞，给予合适浓度的Aβ25-35和姜黄素，通过MTT，流式细胞仪，荧光显微镜、Western Blot等方法检测细胞凋亡的变化。结果显示，在倒置显微镜下观察到20μmol/L Aβ25-35处理组细胞形态与正常组比较，细胞体积变小，突起减少变短，细胞贴壁能力减弱，而经过5μmol/L姜黄素处理后，细胞形态逐渐变大，突起也有恢复，细胞贴壁能力也增强。MTT结果显示姜黄素具有拮抗Aβ25-35毒性的作用，在姜黄素浓度为5μmol/L细胞活力最高（P<0.01），随着剂量逐渐加大，细胞活性开始降低，表明姜黄素在一定剂量范围具有保护作用。荧光显微镜下观察，正常组几乎没有凋亡细胞，偶见零星散在的早期凋亡细胞，即细胞膜染成绿色环状而细胞核未被染色；经20μmol/L Aβ25-35处理过的PC12细胞则出现较多典型的细胞凋亡征象，不仅可见早期凋亡细胞同时可见晚期的凋亡细胞，即胞膜和胞核同时染色，细胞膜染成绿色环状，胞核染成红色；而经5μmol/L姜黄素同时处理的PC12细胞凋亡细胞数目明显减少。流式细胞术结果显示Aβ25-35处理组的细胞凋亡率明显增高，与正常细胞相比有统计学意义，P<0.01；而姜黄素处理组细胞凋亡率有明显的下降，与Aβ25-35处理组相比有统计学意义，P<0.01。表明姜黄素可以保护PC12细胞，使细胞的凋亡率明显下降。线粒体膜电位的测定结果表明，正常情况下，由于线粒体膜电位高，JC-1聚集发出红色荧光；用20μmol/L Aβ25-35处理后，PC12细胞线粒体膜受损，JC-1进入减少，正常的红色荧光逐渐被单体的绿色荧光代替，且细胞形态也发生变化；姜黄素处理组细胞虽然形态未恢复正常的状态，但红色荧光明显比Aβ25-35处理组浓度高。表明姜黄组处理组的线粒体膜电位较Aβ25-35处理组有明显恢复，提示姜黄素可拮抗Aβ25-35所致的氧化应激的增加，保护线粒体膜，减少其损伤。 对caspase-3和p-JNK的检测结果显示，经过Aβ25-35处理的细胞与正常细胞比，caspase-3前体蛋白明显减少，p-JNK表达增高，与正常细胞比较有统计学意义，P<0.01；而经过姜黄素同时处理的PC12细胞，caspase-3前体蛋白表达高于Aβ25-35处理组，p-JNK表达低于Aβ25-35处理组，与Aβ25-35处理组比较有统计学意义，P<0.01，表明在Aβ25-35的作用下，PC12细胞发生凋亡，其与caspase-3蛋白和p-JNK的表达有关，而姜黄素处理可以抑制p-JNK的活化，减少caspase-3蛋白的降解，从而减少细胞凋亡，达到保护生存的目的。 上述结果表明： 1、 Aβ25-35可以诱导体外培养的PC12细胞出现凋亡，主要表现为形态学和细胞凋亡率的变化。 2、 姜黄素可拮抗Aβ25-35的毒性作用，提高Aβ诱导的PC12细胞的活性，降低Aβ诱导的PC12细胞的凋亡率，其机制可能与抑制P-JNK,Caspase-3的活化,改善线粒体膜的损伤有关。