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背景:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是我国常见恶性肿瘤之一,在所有人类肿瘤中约占6%,其发生率在全世界范围正在上升。肝癌患者总的生存期极短,5年生存率低于10%。凋亡抵抗是肝癌治疗失败的重要原因,凋亡抵抗是肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）的特征之一,在HCC发生发展中占有重要地位。凋亡抵抗产生的原因非常复杂。内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）可以导致细胞凋亡,但在ERS下肿瘤细胞发生凋亡并不明显,表明肿瘤细胞可能对ERS产生适应并逃避凋亡。有研究发现,在使用ERS诱导剂衣霉素（Tunicamycin, TM）和布雷菲德菌素（Brefeldin A）可导致乳腺癌MCF-7细胞的COX-2表达上调。而研究发现环氧化酶-2（cycloxygenase-2, COX-2）有明显的抑制凋亡作用,已引起人们的广泛关注。本研究应用ERS诱导剂TM诱导人肝癌细胞株HepG2及人正常肝细胞HL-7702发生ERS,观察其增殖抑制率及细胞凋亡率的变化。检测肝癌细胞发生ERS后COX-2表达的变化,探讨肝癌细胞抵制ERS反应性凋亡途径的可能机制。COX-2转录活性、过度表达水平和延续时段,主要受内转录调控程序和内源性因子,如褪黑素（MT）和干扰素（interferon,INF）等控制。其中,MT把COX-2作为靶分子控制其转录和表达,成为COX-2特异性阻滞剂。所以我们选用COX-2特异性阻滞抑制褪黑素抑制COX-2的表达,观察肝癌细胞ERS后的增殖抑制率及细胞凋亡率的变化。为HCC的治疗找到更多的方法。目的:了解ERS诱导肝癌细胞的凋亡情况及其作用机制,并探讨褪黑素在肝癌细胞抵制ERS诱导的细胞凋亡中的作用。方法:MTT法检测药物作用于人肝癌细胞株HepG2及人正常肝细胞株HL-7702的增殖抑制情况,流式细胞仪PI单染法检测细胞周期DNA含量分析凋亡率,TUNEL法观察药物作用细胞后凋亡细胞形态及各组凋亡率差别,Wertern Blot检测TM诱导的COX-2和GRP 78蛋白表达情况。结果:1. TM及加入褪黑素作用时TM对人肝癌细胞株HepG2和人正常细胞株HL-7702增殖抑制作用1.1 TM对HepG2细胞的增殖抑制作用采用MTT法,观察TM对HepG2细胞的增殖抑制作用。结果显示不同浓度（1.5,3,6,9,12umol/L）TM作用于HepG2细胞后其抑制细胞增殖作用并不明显,12umol/L TM作用48h后增殖抑制率仅达到27.2%。1.2 TM对HL-7702细胞的增殖抑制作用采用MTT法,观察TM对HL-7702细胞的增殖抑制作用。结果显示不同浓度（1.5,3,6,9,12umol/L）TM作用于HL-7702细胞后明显抑制细胞增殖作用。1.5umol/L TM TM作用48h后增殖抑制率可达50.9%。1.3应用褪黑素时TM对HepG2细胞的增殖抑制作用采用MTT法,观察褪黑素作用时TM对HepG2细胞的增殖抑制作用。结果显示应用褪黑素,HepG2对TM诱导的内质网应激诱导的细胞凋亡的敏感性提高,12umol/L TM作用48h后增殖抑制率上升至64.9%。1.4应用褪黑素时TM对HL-7702细胞的增殖抑制作用采用MTT法,观察褪黑素作用时TM对HL-7702细胞的增殖抑制作用。结果显示应用褪黑素及TM组HL-7702细胞与单用TM组的增殖抑制率未见明显差异。2. TM以及加入褪黑素时TM诱导的ERS对HepG2和HL-7702凋亡的影响2.1 TM以及加入褪黑素时TM诱导的ERS对HepG2和HL-7702凋亡影响的TUNEL分析2.1.1 TM以及加入褪黑素时TM诱导的ERS对HepG2凋亡影响的TUNEL分析采用末端双脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记技术（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL）观察HepG2和HL-7702细胞凋亡的形态学改变。研究发现对照组细胞及单用褪黑素组细胞增殖旺盛,仅见少许凋亡细胞;单用TM作用48h后,细胞密度稍见减少,可见少许凋亡细胞;加入褪黑素时TM作用48h后,可见细胞密度明显减少,凋亡细胞数明显增加。2.1.2 TM以及加入褪黑素时TM诱导的ERS对HL-7702凋亡影响的TUNEL分析研究发现对照组细胞及单用褪黑素组细胞增殖旺盛,仅见少许凋亡细胞;而单用TM细胞组及加入褪黑素及TM细胞组作用48h后,细胞密度均见明显减少,凋亡细胞数明显增加。2.2 TM以及加入褪黑素时TM诱导的ERS对HepG2和HL-7702凋亡影响的FCM检测2.2.1 TM以及加入褪黑素时TM诱导的ERS对HepG2凋亡影响的FCM检测应用流式细胞仪（Flow Cytometry,FCM）检测细胞凋亡率。在DNA图谱G0/G1期前出现了一个代表细胞凋亡的亚G1峰即凋亡峰。FCM结果显示,正常对照组可见低矮的凋亡峰,单用TM及单用褪黑素细胞组作用48h后,其凋亡峰未见明显变化。当加入褪黑素时,在TM诱导48h后,其凋亡峰增加。2.2.2 TM以及加入褪黑素时TM诱导的ERS对HL-7702凋亡影响的FCM检测FCM结果显示,正常对照组可见低矮的凋亡峰,单用褪黑素细胞组作用48h后,其凋亡峰未见明显变化。在TM及加入褪黑素时TM诱导48h后,其凋亡峰增加。3.肝癌细胞抵制ERS诱导的细胞凋亡的可能分子机制采用Wertern Blot检测TM诱导的COX-2和GRP 78蛋白表达情况。结果表明,ERS诱导剂TM可诱导GRP78的表达增多,ERS的产生可诱导COX-2表达增多。褪黑素抑制肝癌细胞中ERS诱导的COX-2表达。结论褪黑素提高肝癌细胞对内质网应激诱导的细胞凋亡通路的敏感性