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目的:研究XPA在临床肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）患者中的表达情况以及与临床预后的相关性;探讨XPA在HCC中的生物学功能,以及XPA调控HCC自噬活化,从而触发细胞凋亡的机制;通过建立HCC裸鼠皮下成瘤模型,研究靶向XPA是否可成为HCC新的治疗靶点,为开发HCC新的治疗策略提供理论依据。方法:1.生物信息学分析以及XPA相关检测分析:临床HCC患者预后五年生存曲线来自数据库（The Cancer Genome Atlas,TCGA）,经R语言分析软件分析。WB、qRT-PCR和IHC法检测XPA在不同病理分期的人HCC组织和癌旁非肿瘤肝组织中的表达。WB和qRT-PCR技术检测XPA在人肝肿瘤细胞株Hep3B、Huh7、SMMC7721、SK-Hep-1、Bel7402、HepG2、LM9以及人正常肝细胞株HL7702中的蛋白和m RNA表达水平。2.细胞生物学功能研究:通过慢病毒感染的方式在Hep3B、Huh7肝癌细胞中过表达XPA,通过药物筛选,构建稳定表达XPA的HCC体外细胞实验模型LV-XPA-Hep3B、LV-XPA-Huh7。通过WB和q RT-PCR技术检测LV-XPA-Hep3B、LV-XPA-Huh7肝癌细胞中XPA的蛋白和m RNA表达情况。平板细胞克隆形成实验和CCK-8法检测LV-XPA-Hep3B、LV-XPA-Huh7肝癌细胞增殖。WB技术检测LV-XPA-Hep3B、LV-XPA-Huh7肝癌细胞中上皮-间充质转化（Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）蛋白标志物E-cadherin、N-cadherin和vimentin的表达。Transwell法和细胞划痕实验检测LV-XPA-Hep3B、LV-XPA-Huh7肝癌细胞的侵袭和迁移。3.WB检测LV-XPA-Hep3B、LV-XPA-Huh7肝癌细胞中自噬相关分子LC3B Ⅱ/Ⅰ和Beclin1的蛋白表达以及凋亡相关蛋白Cleaved-caspase-3、Bax和抗凋亡蛋白Bcl2的表达,TUNEL染色检测LV-XPA-Hep3B、LVXPA-Huh7肝癌细胞凋亡的情况。LC3-GFP-m RFP荧光双标慢病毒系统及激光共聚焦显微镜检测自噬流。经RAPA和3-MA处理LV-XPA-Hep3B、LV-XPA-Huh7肝癌细胞,通过WB检测自噬相关蛋白LC3B Ⅱ/Ⅰ和Beclin1的表达水平。4.细胞学机制研究:WB检测经IGF-1处理后LV-XPA-Hep3B、LV-XPA-Huh7肝癌细胞中自噬分子LC3B Ⅱ/Ⅰ、Beclin1及PI3K/AKT/mTOR信号通路分子AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K、mTOR和p-mTOR的表达水平变化。5.裸鼠皮下成瘤体内实验:用LV-NC-Hep3B和LV-XPA-Hep3B肝癌细胞构建HCC裸鼠皮下成瘤实验模型,测量皮下成瘤瘤体体积、重量,并绘制生长曲线。裸鼠肿瘤组织提取物经WB检测XPA、LC3BⅡ/Ⅰ、Beclin1、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR等蛋白的表达,IHC检测XPA、LC3B的表达,TUNEL染色检测肿瘤组织细胞凋亡。结果:1.经过TCGA数据库中收集的349个HCC患者的生存数据和基因表达信息分析发现,XPA高表达的HCC患者5年生存率较低表达的患者明显升高,同时我们发现XPA表达水平与年龄相关。2.XPA在人HCC组织中的表达水平低于癌旁非肿瘤肝组织,XPA表达水平越高,HCC患者的总体生存期越高,且疾病预后好。与人正常肝细胞系HL7702相比,人肝肿瘤细胞系SMMC7721、HepG2、SK-Hep-1、LM9、Bel7402、Hep3B和Huh7中XPA m RNA和蛋白水平表达降低,其中以两种HCC细胞株Hep3B和Huh7表达最低。3.通过慢病毒感染的方式在Hep3B和Huh7肝癌细胞中过表达XPA,构建稳定表达XPA的LV-XPA-Hep3B、LV-XPA-Huh7肝细胞癌体外细胞实验模型。与LV-NC组相比,LV-XPA组HCC细胞中XPA的m RNA和蛋白表达水平均显著上调。4.与LV-NC组相比,LV-XPA组HCC的细胞增殖受到抑制。LV-XPA组HCC细胞中E-cadherin蛋白表达增加,N-cadherin和vimentin蛋白表达降低。LV-XPA组HCC细胞的侵袭和迁移都被显著抑制。5.与LV-NC组相比,LV-XPA组HCC细胞中LC3B Ⅱ/Ⅰ和Beclin1的蛋白表达水平显著升高,而p62表达水平下降,Cleaved-caspase-3和Bax的蛋白表达水平增加,Bcl2蛋白表达水平降低。TUNEL染色显示,LV-XPA组HCC细胞的凋亡小体数量远高于LV-NC组,表明自噬的激活可能促进细胞凋亡。LC3-GFP-m RFP自噬双标慢病毒系统结果显示,与LV-NC组相比,LV-XPA组HCC细胞中的荧光斑点明显增多,merge后的红色及黄色斑点明显增多,提示自噬流增强,表明过表达XPA能有效增强自噬流。6.使用RAPA和3-MA处理LV-XPA-Hep3B、LV-XPA-Huh7肝癌细胞,结果显示,RAPA和XPA单独作用于HCC细胞时,都能有效诱导HCC细胞致死性自噬,LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1蛋白表达水平升高;当RAPA和XPA共同作用于HCC细胞时,自噬诱导功能更强。3-MA单独作用于HCC时,LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1蛋白表达被部分抑制,但是当3-MA与XPA共同作用于HCC细胞时,与LV-XPA组相比,LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1蛋白表达水平降低,表明3-MA抑制了XPA诱导的自噬激活。7.使用不同浓度IGF-1处理HCC细胞,p-AKT表达水平以IGF-1剂量依赖性方式被上调,并且在200ng/m L和300ng/m L浓度时作用最强,两者没有统计学差异。LV-XPA组HCC细胞中LC3B Ⅱ/Ⅰ和Beclin1蛋白表达水平增加,而IGF-1抑制这些蛋白的表达。在HCC细胞中仅过表达XPA时,p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表达水平部分降低;相对于IGF-1单独作用,IGF-1和LV-XPA共同作用于HCC细胞时,p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表达水平相对降低。结果表明,通过上调XPA来激活HCC细胞自噬,其可能是依赖于调节PI3K/AKT/mTOR信号通路实现的。8.通过构建LV-XPA-Hep3B肝细胞癌裸鼠皮下成瘤模型,研究发现,与LV-NC组裸鼠相比,LV-XPA组裸鼠的平均肿瘤体积和肿瘤重量较小,裸鼠的生存期较长。LV-XPA组裸鼠肿瘤组织中XPA、LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1蛋白表达水平升高,p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表达水平降低。IHC与WB结果一致,IHC染色显示XPA表达在LV-XPA组裸鼠肿瘤组织中显著增加,并且LC3B表达也有所增加。TUNEL染色发现,与LV-NC组相比,LV-XPA组裸鼠肿瘤组织中发生凋亡的细胞数目增加。所有这些数据表明,XPA可以诱导肝细胞癌裸鼠皮下成瘤瘤体组织的自噬和促进凋亡,且该作用可能是通过PI3K/AKT/mTOR信号通路实现的。结论:1.XPA对于临床HCC患者可能是一种预后良好的潜在标志物。2.XPA的表达水平在人HCC组织和人HCC细胞系中对比癌旁非肿瘤肝组织和人正常肝细胞系明显降低。3.成功构建过表达XPA的HCC细胞实验模型,在HCC细胞中上调XPA表达,证实了XPA通过增加E-cadherin蛋白表达和减少N-cadherin、vimentin蛋白表达来抑制HCC细胞EMT。在HCC细胞中上调XPA表达,显著抑制了HCC细胞的增殖、侵袭和迁移能力。4.过表达XPA通过增加LC3B Ⅱ/Ⅰ、Beclin1并降低p62蛋白表达水平来诱导HCC细胞自噬,自噬相关蛋白的表达水平和自噬体数量与XPA表达水平呈正相关。同时,凋亡相关蛋白Cleaved-caspase-3和Bax的蛋白表达水平增加,Bcl2蛋白表达水平降低,凋亡相关蛋白的表达水平和凋亡小体的数量与XPA表达水平呈正相关,抗凋亡蛋白的表达水平与XPA表达水平呈负相关。XPA诱导HCC细胞自噬的作用可被RAPA增强,被3-MA逆转,表明XPA可以诱导致死性自噬的激活,从而可能促进细胞凋亡,说明致死性自噬在XPA抑制HCC细胞的过程中有着重要作用。5.XPA可以逆转IGF-1对信号通路的激活作用,以及XPA可以逆转IGF-1对自噬的抑制作用,表明XPA可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活达到抑制HCC的目的,这一作用可能是通过诱导HCC致死性自噬发生的。6.成功构建HCC裸鼠皮下成瘤模型,与LV-NC组相比,LV-XPA组裸鼠皮下肿瘤生长被显著抑制,裸鼠生存期明显延长。XPA可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路从而诱导HCC致死性自噬,促进肿瘤细胞凋亡,最终抑制HCC的发生和发展。