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脑卒中为临床常见病和多发病,具有发病率高、致残率高、死亡率高和复发率高的特点,缺血性脑卒中为脑卒中最常见的类型,然而,临床上迄今仍缺乏疗效明确的治疗药物,曾被寄予厚望的N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)拮抗剂由于阻断了受体的正常生理功能而未能在临床上取得成功。NR2B9c(KLSSIESDV)是一个针对NMDA受体亚型NR2B羧基端的9个氨基酸残基的多肽,NR2B9c可与突触后密集区蛋白-95(postsynaptic density-95,PSD-95)特异性结合,解除NMDAR/PSD-95偶联,阻断引起神经兴奋性毒性的下游信号传导,但不影响NMDA受体的正常生理功能,其神经保护作用已在类似于人类的灵长类动物身上被证实。NR2B9c是一种极有临床应用前景的治疗缺血性脑卒中的多肽,但目前相关研究均集中在作用机制方面,其它方面尚未见文献报道,且现有实验中均由源自HIV的Tat携带NR2B9c透过血脑屏障。由于Tat在安全性方面存在很大争议,为将NR2B9c高效安全的递送入脑,在本项研究中,我们建立了NR2B9c的体内、体外分析测试方法,并对NR2B9c的基本理化性质及其稳定性进行了考察,构建了包载NR2B9c的麦胚凝集素(wheat germ agglutinin,WGA)修饰的聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)-聚乳酸羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)纳米粒并进行优化和表征,评价了载NR2B9c的纳米粒(nanoparticle,NP)在生理和病理条件下的脑内递药特性,考察了WGA修饰的载NR2B9c纳米粒的在体内外的神经保护作用,还对纳米粒安全性的进行初步探讨。第一章NR2B9c的处方前研究建立了NR2B9c的体外高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)分析方法,并利用此法对NR2B9c的基本理化性质及稳定性进行了考察。NR2B9c的等电点预测为4.37;NR2B9c在水中具有非常好的溶解性,而在有机溶剂中的溶解性能均很差;NR2B9c在正辛醇-水体系中油水分配系数为0.026±0.003,说明NR2B9c属于水溶性很高、脂溶性极低的药物,其跨膜转运能力非常差,因此要寻找合适的递药系统来提高NR2B9c透过生物膜的能力。NR2B9c在水溶液中的降解符合一级动力学过程,p H7.5为其最稳定的p H,适度增加体系的离子强度,降低缓冲液浓度,降低NR2B9c的浓度,减小溶剂极性,使用抗氧剂及低温环境对提高NR2B9c的稳定性非常有利,在制剂制备过程中,若使用超声设备,应注意超声功率和超声时间,了解和掌握上述理化性质及稳定性影响因素,对于发展NR2B9c的药物传递系统非常有必要。第二章麦胚凝集素修饰的NR2B9c聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸共聚物纳米粒的制备、表征与制剂学评价构建包载水溶性多肽类药物的WGA修饰的PEG-PLGA纳米粒;以粒径、载药量及WGA的连接效率为指标,采用Box-Behnken效应面法优化NR2B9cWGA-NP的处方与制备工艺,考察纳米粒外观形貌、粒径分布、Zeta电位、包封率和载药量等理化特征,通过优化所制得NR2B9c-WGA-NP为类球形粒子,外观圆整,NR2B9c-WGA-NP的平均粒径140 nm,纳米粒分布均匀,呈现淡蓝色乳光,Zeta电位约为-23 m V,包封率为50%,载药量为11%,NR2B9c-WGA-NP上WGA的连接效率为60%,WGA连接密度为每mg纳米粒17.99μg WGA,红细胞凝集试验说明载NR2B9c的PEG-PLGA纳米粒表面连接的WGA仍然能保持其生物活性,证实采用的连接方法得当。纳米粒性状优良,可用于后续实验研究。NR2B9c-WGA-NP胶体溶液的释放曲线符合Weibull方程,具有明显的缓释效应。NR2B9c-WGA-NP胶体溶液在4°C冰箱中放置1个月内能基本保持稳定,甘露醇被证明是纳米粒最适合的冻干保护剂。NR2B9c制成聚合物纳米粒后,在血浆和鼻洗液中稳定性显著提高。第三章麦胚凝集素修饰的聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸共聚物纳米粒经鼻入脑递药特性评价采用香豆素-6为荧光探针,考察WGA修饰的纳米粒体外摄取及鼻腔给药后脑内递药特性,结果发现Calu-3细胞和神经元对载香豆素-6的纳米粒的摄取呈现出时间、浓度和温度依赖性,且这两种细胞对WGA修饰的纳米粒的内吞量均显著高于未修饰的纳米粒;无论是Calu-3细胞还是原代神经元,纳米粒的摄取均可被实验浓度的网格蛋白介导的内吞途径抑制剂氯丙嗪和蔗糖,小窝蛋白介导的内吞途径抑制剂甲基-β-环糊精,能量抑制剂叠氮钠及溶酶体酸性环境调节剂莫能星所抑制,WGA-NP的摄取可被WGA特异性糖基底物N-乙酰-D-氨基葡萄糖所抑制,而未修饰的纳米粒不受影响,此外在Calu-3细胞和神经元上均展示出部分溶酶体的红色荧光与载香豆素-6纳米粒的绿色荧光共定位;提示纳米粒经网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞途径进入细胞,在胞内转运过程中部分纳米粒进入了溶酶体,细胞内吞过程需要消耗能量。载香豆素-6的纳米粒鼻给药后,WGA修饰的纳米粒能显著增加所携载的荧光探针的入脑量,并减少了其在外周组织的分布。以罗丹明(5-Carboxytetramethylrhodamine,5-TAMRA)修饰的NR2B9c为模型药物制备纳米粒,考察Calu-3和神经元细胞对纳米粒及药物的摄取,建立NR2B9c体内分析测试方法,评价载NR2B9c的纳米粒经鼻腔给药进入脑部的递药能力,结果发现两种细胞对载5-TAMRA-NR2B9c的纳米粒的摄取均明显多于游离药物,WGA对纳米粒的修饰可进一步促进5-TAMRA-NR2B9c的摄取。鼻腔给予NR2B9c溶液后,其可沿鼻脑通路直接转运入脑,和静注相比增加了NR2B9c脑部转运量;纳米粒包载NR2B9c后能够促进NR2B9c在鼻腔的吸收,提高NR2B9c的稳定性,进一步提高了NR2B9c的脑转运量;而WGA修饰的纳米粒比未修饰的纳米粒更能提高NR2B9c的入脑量。在局灶性脑缺血模型大鼠上评价纳米粒经鼻入脑的能力,结果表明WGA修饰的纳米粒能显著增加所携载的近红外荧光探针Di R在MCAO模型大鼠上的入脑量,局灶性脑缺血模型大鼠鼻腔给予载NR2B9c的纳米粒1h后,纳米粒组在左侧、右侧大脑皮层及嗅球和嗅束中的浓度都比NR2B9c溶液组高。第四章麦胚凝集素修饰的NR2B9c聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸共聚物纳米粒的神经保护作用及初步安全性评价采用NMDA诱导神经元损伤,通过乳糖脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)法和PI(propidium iodide,PI)染色来评价载NR2B9c纳米粒的神经保护作用,并采用成年大鼠大脑中动脉阻塞(intraluminal middle cerebral artery occlusion,MCAO)制备局灶性脑缺血再灌注模型,评价载NR2B9c纳米粒鼻腔给药后的抗脑缺血损伤作用。体内外实验结果都表明,NR2B9c-WGA-NP与阳性对照药Tat-HA-NR2B9c一样具有神经保护作用,作用优于NR2B9c和NR2B9c-NP。采用CCK法评价了纳米粒对Calu-3细胞和神经元的细胞毒性,结果表明无论在Calu-3细胞还是原代神经元上,载药纳米粒和空白纳米粒在实验浓度范围内均未呈现出明显的细胞毒性。空白纳米粒和载药纳米粒鼻腔连续给药7天后,嗅球和其它脑区以及心、肝、脾、肺、肾中TNF-α的含量没有明显变化;心、肝、脾、肺及鼻腔均未发生明显的组织病理学改变,说明空白纳米粒和载药纳米粒在实验剂量并不会产生相应的免疫效应及炎症反应,纳米粒并无明显毒性反应。结论:WGA修饰的PEG-PLGA纳米粒,是经鼻入脑的一种优良载体,其可为NR2B9c提供一种安全有效的脑部递药方法,本研究对其它具有中枢治疗作用的多肽蛋白类药物亦有一定借鉴作用。