研究背景：雌激素是一种十八碳固醇类激素,由脊椎动物的卵巢、睾丸、胎盘或肾上腺皮质所产生的。大多数哺乳动物的雌激素主要是17β-雌二醇,其他重要的雌激素还有雌三醇和雌酮。雌激素是一类具有广泛生物学活性的类固醇化合物,不仅可以促进和维持女性生殖器官和第二性征,并且对内分泌系统、心血管系统、造血系统、肌体的代谢、骨髂的生长和成熟均有明显的影响。骨髓造血功能是由造血干细胞及其所处的造血微环境之间的相互作用来共同实现的。造血干细胞是一种多潜能成体干细胞,具有干细胞的两大特性,即自我更新和多向分化。一方面通过细胞不对称分裂来完成自我更新的过程以维持造血干细胞数量的相对恒定,另一方面则是在骨髓造血微环境各种基质细胞及其分泌的多种细胞因子的调控下分化为不同谱系的造血前体细胞,并进一步分化为各系成熟的造血细胞,最终释放入外周血以满足机体正常造血需要。而发挥造血调控作用的骨髓造血微环境中的主要组成成分,则是由骨髓间充质干细胞分化发展而来的。间充质干细胞也是一类多能干细胞,同样具有自我分裂增殖和多向分化的潜能。间充质干细胞在不同的诱导条件下,可向成脂、成骨、成软骨等多种细胞分化,并对骨髓造血功能起着支持、调节、辅助等作用。而成骨细胞又是造血干细胞所处的微环境,即造血干细胞壁龛中的重要组成部分,一方面其分泌的相关粘附因子可以将造血干细胞锚定在骨内膜表面,另一方面成骨细胞通过自分泌或旁分泌各种类型的细胞因子来调节造血干细胞的数量和功能。新近有研究发现,骨髓造血干细胞和间充质干细胞的表面均存在有雌激素受体,提示内分泌系统和造血系统之间可能存在着潜在的内部联系。根据这一发现,我们提出了此次实验研究的基本思路,主要是从体内和体外两个方面深入研究在雌激素浓度发生改变的情况下大鼠骨髓造血功能,包括造血干细胞和间充质干细胞的相关功能是否受到相应影响并分析其可能的作用机制。通过这一研究,更进一步将机体内分泌系统和造血系统有机的联系起来,并为将来临床上治疗由于激素改变而引起的各种类型的血液系统疾病寻找新的诊治思路和治疗手段,提供更充足的理论依据。第一章雌激素对去卵巢大鼠造血功能的影响及其机制的研究目的：探讨体内雌激素改变对骨髓造血功能的影响及其可能的机制。方法：利用去卵巢手术构建雌激素缺乏的大鼠模型,通过骨髓病理切片中各组分(包括造血组织、脂肪组织及骨小梁、成骨细胞、破骨细胞)的比例、髓外造血情况以及外周血改变来确定骨髓造血功能衰竭程度,并通过流式分析、克隆形成实验来明确雌激素改变是否对造血干细胞的数量和功能产生影响,以及通过ELISA法检测血清中造血生长因子,如GM-CSF、IL-3、SCF、Epo和TPO的表达量来说明雌激素对造血微环境的影响。结果：比较去卵巢组和假手术组,结果发现去卵巢术后第12周时雌激素水平出现明显下降,骨髓病理切片中造血组织/巨核细胞、骨小梁、成骨细胞所占比例明显减少,而脂肪组织和破骨细胞所占比例相应增高,并伴随有自术后第16周起开始出现的髓外造血灶,且与相应时间段假手术组之间均存在显著性差异(p<0.05)自术后第24周起,上述指标在两组间的差异逐渐缩小(p>0.05)。而外周血中Hb和PLT的比例从去卵巢术后第24周起出现明显下降,WBC在术后第28周时出现明显下降(p<0.05)。骨髓HSC/HPC形成CFUs-GM的数目和HSC数量从去卵巢术后第16周始先后出现明显下降,并伴随肝脾髓外器官中HSC数量的明显升高(p<0.05)。与假手术组相比,造血生长因子GM-CSF、SCF、IL-3从去卵巢术后第12周至第24周先后出现明显下降,而Epo和TPO则从第12周开始即出现明显升高(p<0.05)结论：双侧卵巢切除术能成功建立大鼠骨质疏松模型。去卵巢大鼠雌激素缺乏后可出现骨髓造血功能的减低,肝脾髓外造血的代偿,并最终导致外周血血细胞的减少。大鼠骨髓造血功能的减低与造血组织/巨核细胞、成骨细胞减少以及脂肪细胞增多有关；同时伴有造血干细胞数量的减少和功能的降低。且造血生长因子也参与了骨髓造血功能的调控。去卵巢大鼠是用来研究骨髓造血功能减退的理想模型,其大鼠最佳年龄段为3-9月龄。第二章雌激素对骨髓间充质干细胞和造血干细胞的影响目的：探讨体外雌激素对骨髓间充质干细胞的生长、增殖及分化及造血干细胞功能的影响。方法：通过全骨髓贴壁法及密度梯度离心法获取SD大鼠骨髓间充质干细胞,通过流式分析仪鉴定细胞表面标志及油红O及茜素红染色、RT-PCR、ELISA法来检测成脂、成骨诱导分化等相关指标。并在体外不同雌激素浓度(0,0.001nmol/L,0.01nmol/L,0.1nmol/L,1nmol/L)刺激下观察间充质干细胞的生长曲线及其对间充质干细胞成脂、成骨分化的影响以及通过RT-PCR方法来检测间充质干细胞表面的相关雌激素受体α和β表达情况。通过免疫磁珠法分离及流式细胞分析仪鉴定骨髓来源的造血干细胞比例。在倒置显微镜下观察其形态并通过克隆形成实验分析在不同雌激素浓度(0,0.01nmol/L,1nmol/L)刺激下造血干细胞形成CFUs-GM的能力。结果：收集获得的骨髓间充质干细胞的表面标志为CD29、CD44、CD90高表达,而CD45和CD34低表达。倒置显微镜下观察间充质干细胞形态后发现培养初期呈圆形、三角形或不规则形,而到培养后期呈现纺锤体形或呈现向四周放射样生长状态。骨髓间充质干细胞在成脂诱导下形成大小不一的脂滴,可被油红O染成橘红色,RT-PCR检测其LPLmRNA表达量明显增高。而在成骨诱导下所形成的钙结节则可被茜素红染成红色。在不同雌激素浓度作用下时,成脂分化的指标,如油红O染色程度随雌激素浓度升高而降低,成骨分化的相关指标,如茜素红染色程度及骨钙素分泌量随雌激素浓度升高而升高。成骨分化时雌激素受体α和β表达量与未诱导时相比无明显差异(p>0.05),成脂分化时雌激素受体α与未诱导时相比明显下降,而雌激素受体β与未诱导时相比明显升高(p<0.05)。免疫磁珠分离法可大大提高骨髓造血干细胞的回收率,倒置显微镜下观察造血干细胞,可见细胞体积偏小,圆形或椭圆形,大小较均一,可见一个或多个大小不一的核仁。在不同浓度雌激素作用下,造血干细胞形成CFUs-GM的能力与雌激素浓度呈正相关,即随着雌激素浓度的升高,CFUs-GM的数目相应增加。结论：利用全骨髓贴壁法及密度梯度离心法可在体外成功分离、纯化、培养及传代SD大鼠的骨髓来源的间充质干细胞。雌激素可促进骨髓间充质干细胞更倾向于向成骨诱导分化,而成脂诱导分化相应减少。雌激素受体α和β在成骨诱导分化时其表达量与未诱导时相比无明显差异,而在成脂诱导分化过程中,雌激素受体α明显减少,而雌激素受体p明显增加。通过免疫磁珠分选法可大大提高造血干细胞体外获取的纯度。雌激素对造血干细胞的增殖分化会产生一定的影响。伴随雌激素浓度的升高,造血干细胞分化至粒/巨噬细胞克隆形成单位的能力有所增强。