【摘 要】
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产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是引起仔猪腹泻的主要病原体之一,感染后引起仔猪黄痢、白痢和水肿病等。患病仔猪主要临床症状为腹泻、脱水、消瘦,严重时可引起死亡,给养猪业造成巨大的经济损失。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA。研究发现,细菌感染可引起宿主细胞内l
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产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是引起仔猪腹泻的主要病原体之一,感染后引起仔猪黄痢、白痢和水肿病等。患病仔猪主要临床症状为腹泻、脱水、消瘦,严重时可引起死亡,给养猪业造成巨大的经济损失。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA。研究发现,细菌感染可引起宿主细胞内lncRNA表达异常,参与调控疾病的发生发展。本研究通过高通量测序分析ETEC感染猪小肠上皮细胞进程中细胞中lncRNA的表达变化情况,从中筛选与ETEC感染相关的lncRNA并研究其功能,探索ETEC感染的分子机制,为揭示仔猪腹泻发病机制和发现新的预防治疗靶点提供理论基础。首先,采用ETEC F41菌株感染猪小肠上皮细胞(IPEC-J2),在感染前、感染初期和感染末期进行lncRNA高通量测序,筛选出ETEC感染不同时期的差异表达lncRNA,并利用qRT-PCR验证测序数据的可靠性。结果表明,在IPEC-J2细胞中共鉴定出新发现的lncRNA 10150条。其中,感染初期较感染前共发现100条差异表达lncRNA,其中40条表达上调,60条表达下调;感染末期较感染前共发现161条差异表达lncRNA,其中65条表达上调,96条表达下调。其次,通过lncRNA与蛋白编码基因的位置关系和表达相关性分析方法对差异表达lncRNA的靶基因进行预测。通过对差异表达lncRNA预测靶基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析可见,在ETEC感染IPEC-J2细胞过程中,lncRNA主要参与了细胞生物合成、代谢调控、信号传导、细胞周期及免疫功能调控。基于差异表达分析,发现了候选lncRNAMPHOSPH9-OT1在感染初期和末期表达均显著升高,感染初期log2 fold change为14.08(P<0.01),感染末期log2 fold change为16.14(P<0.01),表明其在ETEC感染中可能发挥关键的调控功能。同时检测了猪不同组织中MPHOSPH9-OT1的表达量,结果表明MPHOSPH9-OT1在肠道、心脏、肝脏等器官中均有表达,肠道组织中表达量较高。利用shRNA干扰和慢病毒转染技术,建立了敲低和过表达MPHOSPH9-OT1的IPEC-J2稳转细胞株。通过检测敲低和过表达MPHOSPH9-OT1的IPEC-J2细胞的单层细胞跨膜电阻(TEER)值,细胞间紧密连接蛋白Occludin,Claudin-1,ZO-1的表达量,以及ETEC细胞黏附率,发现MPHOSPH9-OT1的正常表达对维持肠道屏障的稳态具有重要作用。利用qRT-PCR分析13个预测靶基因的表达变化,结果表明,CXCL8 mRNA的表达与MPHOSPH9-OT1表达具有显著相关性。同时,在ETEC感染初期和末期,MPHOSPH9-OT1靶向调控了 CXCL8的表达,初步验证了其靶基因为CXCL8。综上所述,在ETEC感染后会引起IPEC-J2细胞中大量lncRNA差异表达,这些差异表达的lncRNA广泛参与了细胞完整性、增殖凋亡及免疫相关的生物学过程和分子通路,表明lncRNA在ETEC感染的过程中发挥了重要的调控作用。我们从中筛选到差异表达lncRNAMPHOSPH9-OT1可能通过调控CXCL8的表达,进而调节肠道屏障功能及其完整性。本研究为进一步阐明宿主细胞与ETEC感染的相互作用机制提供了理论基础,为防治ETEC感染引起的仔猪腹泻提供了新思路。
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