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目的：树突状细胞（Dendritic cells，DC）是专职抗原提呈细胞，可有效诱导初始T细胞（Naive T cell）活化，促进细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）和辅助性T细胞（T help cells，Th）的分化。因此，越来越多的研究者正试图利用DC疫苗来治疗包括肿瘤在内的多种疾病。随着对DC疫苗研究的深入，发现肿瘤DC疫苗的免疫效应受到肿瘤微环境的限制。肿瘤细胞通过释放IL-10、IL-6、VEGF及M-CSF等细胞因子，上调DC的stat3磷酸化水平，抑制DC疫苗的活性。MiR-21是一种在多种肿瘤细胞中高水平表达的miRNAs，通过对肿瘤细胞stat3/IL-6、TGF-β等多个靶基因的调控，参与肿瘤微环境的调节。本研究首先制备敲低stat3的肿瘤DC疫苗，利用乳腺癌荷瘤小鼠模型，观察抑制肿瘤miR-21并联合敲低stat3的DC疫苗的抗肿瘤作用，为临床DC疫苗的制备及应用提供实验依据。方法：1制备敲低stat3的DC疫苗（1）制备小鼠来源的树突状细胞（BMDCs）：常规制备小鼠骨髓细胞，用mGM-CSF和mIL-4诱导DC细胞分化。（2）携带敲低stat3基因的慢病毒包装并感染DC细胞：体外培养293T细胞株，按照试剂盒说明书进行慢病毒包装。用新鲜的病毒液感染体外培养第4天的DC细胞。（3）肿瘤抗原负载DC细胞并诱导其成熟：用X射线照射过的4T1细胞裂解液（含50μg/ml的蛋白）负载培养至第6d的DC细胞，继续培养12h。然后换成含LPS+IFN-γ的培养基诱导36h，使DC细胞成熟，至此得到了敲低stat3基因的肿瘤DC疫苗。2验证DC疫苗中stat3的表达情况：分别提取敲低stat3的DC疫苗总RNA和总蛋白，通过real-time PCR和western blot方法，检测DC疫苗中stat3的表达。3敲低stat3基因的DC疫苗活性检测（1）流式细胞术检测敲低stat3的DC表面分子ICAM-1、CD86和MHC-II的表达。收集敲低stat3的DC，分别加入APC标记的抗小鼠CD11c和PE标记的抗小鼠CD86、MHC II及ICAM-1抗体，流式细胞仪分析CD11c+细胞的表面标记MHC II、ICAM-1及CD86的表达情况。（2）敲低stat3的DC培养上清中细胞因子的水平：收集DC细胞培养上清，用ELISA法测定培养上清中IL-12p40/p70的含量。4抑制肿瘤miR-21表达联合敲低stat3的DC疫苗的抗肿瘤活性观察（1）建立小鼠乳腺癌荷瘤模型：将4T1细胞经皮下接种给雌性、7-8周balb/C小鼠（6只/组）。待肿瘤块体积达到200mm3，瘤旁注射携带抑制miR-21的质粒（100μg/只），3d后再注射一次。末次注射后第3天，瘤旁注射敲低stat3的DC疫苗（106/只），一周后再注射一次DC疫苗。（2）观察肿瘤生长：接瘤后每天观察肿瘤生长情况，并每隔3天用游标卡尺测量肿瘤块的直径，按公式（长径×短径2）/2计算肿瘤块的体积（mm3），并绘制肿瘤生长曲线。（3）抑制肿瘤miR-21表达联合敲低stat3的DC疫苗对乳腺癌荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞功能影响末次DC疫苗免疫后的第7天，处死荷瘤小鼠，流式细胞仪分析产生IFN-γ的CD8+T细胞频数及CD4+CD25+的Treg细胞频数；微量LDH法检测脾脏细胞毒性T淋巴细胞的溶细胞活性（CTL）结果：1通过细胞转染的方法，从四个携带抑制stat3表达的质粒中筛选出对stat3抑制效率最高的质粒。2与对照组比较，stat3在敲低stat3的DC细胞中的表达水平下降（蛋白水平降低70%，mRNA水平下降30%）。3与对照组比较，敲低stat3的DC细胞的ICAM-1、MHC II及CD86的表达明显增加，且促进IL-12的分泌。4抑制miR-21联合敲低stat3的DC疫苗，可显著减缓荷瘤鼠肿瘤的生长；提高小鼠脾淋巴细胞IFN-γ的产生和CTL活性。但对荷瘤小鼠脾脏Treg细胞的分布无明显影响。结论：1通过慢病毒转导的方法获得了敲低stat3基因的肿瘤DC疫苗；2敲低stat3增加DC表面MHC II类分子表达和IL-12分泌；3抑制肿瘤细胞的miR-21表达后，可提高敲低stat3的肿瘤DC疫苗的抑瘤作用；4抑制肿瘤miR-21联合敲低stat3的肿瘤DC疫苗，可提高荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞IFN-γ产生和CTL活性；但对Treg细胞的在脾脏中的分布无关。