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斑蝥素是芫菁科等昆虫体内合成的一种天然的防御性毒素,其在癌症及多种皮肤病症的治疗方面有着出色的疗效,同时作为一种潜在的新型生物源农药在农业病虫害防治方面也显示出不凡的效果。由于斑蝥素的自然生物资源有限而化学合成成本高昂无法实现大规模生产,因此明确斑蝥素在芫菁体内的生物合成途径及机理将为解决斑蝥素人工合成并实现规模化生产提供必要的科学依据。由于目前关于斑蝥素的生物合成所知甚少且尚无明确的定论,为了明确芫菁科昆虫体内斑蝥素的生物合成途径,本研究以中华豆芫菁为材料,利用转录组测序技术、荧光实时定量技术以及RNA干扰技术等,对中华豆芫菁交尾后雄虫体内与斑蝥素合成有关的基因及斑蝥素可能的合成途径进行了研究与探讨,并根据与斑蝥素合成有关的基因在斑蝥素合成不同时期雌、雄虫体内各组织的表达情况,以及不同时期雌、雄虫各组织内斑蝥素含量变化情况的检测结果,对交尾后中华豆芫菁雄虫体内可能与斑蝥素合成有关的组织进行了预测。主要的研究成果如下:1.中华豆芫菁雌、雄虫RNA-seq分析以中华豆芫菁刚结束交尾的雄虫(R1)、交尾后7d的雄虫(R2)和羽化后3d的雌虫(R3)为转录组测序样本研究了中华豆芫菁体内基因的表达情况。分别在R1,R2和R3共3组样本中得到了1.3亿、1.5亿和1.5亿的clean reads和46696条unigenes,主要集中在细胞组成,分子功能和生物学过程这三大类功能中。不同样本间基因的差异表达分析发现,R1 vs R2组中共有627个差异表达基因、R1 vs R3组共有2481个差异表达基因,且差异基因被特异的富集到化学排斥的分子功能上,同时该组中有6个差异表达基因分别被显著富集到P450酶外源物质代谢途径和药物代谢途径中;R2与R3样本组中共有2989个差异表达基因,GO富集分析的分子功能与R1 vs R3组相同。通过分析雌、雄虫的差异表达基因在萜类骨架合成途径中的富集发现,分别有5个调控酶基因被富集到萜类骨架生物合成途径中的甲羟戊酸(Mevalonate,MVA)途径中,以及3个酶基因被富集到其下游分支途径。2.基于MVA途径的差异表达基因初筛成功构建出具有斑蝥素含量差异的基因筛选模板,并利用差异筛选模板从候选的73个差异表达基因中筛选出具有相关表达差异的基因14个。利用RNA干扰的方法对其中的EcUn7,EcUn14和EcCYP4C基因与斑蝥素合成的关系进行验证,结果表明干扰EcUn7和EcCYP4C基因的表达可以显著地抑制中华豆芫菁雄虫体内斑蝥素的合成。利用5’及3’RACE的方法对EcUn7和EcCYP4C基因的全长进行了克隆,并通过生物信息学分析发现其分别编码1种围食膜蛋白和1种细胞色素P450中4家族的蛋白CYP4BM1。3.MVA途径下游相关基因与斑蝥素合成的关系成功克隆得到中华豆芫菁MVA途径下游EcFDRs,EcPFTb以及EcGGPS基因全长序列,并对3个基因的时空表达进行了检测,其在交尾后不同时间的雌、雄虫体内有着不同的表达趋势,但均在卵和初龄幼虫体内具有高表达。交尾后中华豆芫菁雄虫体内斑蝥素的含量持续升高,并在第6d和7d达到峰值,而雌虫体内的斑蝥素含量则始终维持在相同的高水平;中华豆芫菁卵中含有较高的斑蝥素含量,最低值则出现在2龄和3龄幼虫体内。通过RNA干扰实验证明,干扰EcPFTb和EcGGPS基因均对交尾后雄虫体内斑蝥素的合成没有明显影响,而干扰交尾后雄虫体内EcFDRs基因的表达,可以显著地抑制其体内斑蝥素的合成。4.JH合成与代谢相关基因对斑蝥素合成的影响成功克隆得到中华豆芫菁体内的EcMFE,EcJHEH和EcJHAMT基因cDNA全长序列。EcMFE、EcJHAMT和EcJHEH基因在交尾后雄虫体内的mRNA表达趋势与斑蝥素含量变化趋势相似。EcMFE基因在1龄幼虫、EcJHAMT基因在2龄和3龄幼虫体内具有远高于其它虫龄的表达量,EcJHEH基因在1龄幼虫和伪蛹中具有相对较高的表达量。RNA干扰实验证明,分别干扰EcMFE和EcJHEH基因的表达可以显著地抑制交尾后中华豆芫菁雄虫体内斑蝥素的合成,而干扰EcJHAMT基因对雄虫体内斑蝥素合成没有显著抑制效果,推测JH可能不是雄虫体内斑蝥素的合成的直接前体。5.斑蝥素及其合成相关基因在中华豆芫菁各组织内的分布与变化比较分析了对斑蝥素合成有显著调控作用的EcHMGR基因在中华豆芫菁体内的时空表达水平,同时为了消除不同性别造成的表达差异,我们比较了中华豆芫菁与另一种不产斑蝥素的鞘翅目的近缘种——黄粉虫在不同发育时期及雄虫各组织间的HMGR基因的表达差异,发现其在中华豆芫菁雄虫脂肪体中具有显著组织地特异性高表达,斑蝥素含量的检测也显示脂肪体具有仅次于雄性附腺(斑蝥素富集组织)的高斑蝥素含量。中华豆芫菁交尾后不同时期各组织内斑蝥素含量的检测结果显示,雄虫附腺和脂肪体内斑蝥素含量均随着时间增加不断升高,且脂肪体中斑蝥素含量水平仅次于附腺。与斑蝥素合成有关的各基因在对应组织内的表达检测结果显示,EcHMGR和EcJHEH基因在雄虫脂肪体中均有显著地高表达,且EcHMGR基因的表达量有随时间增加而上升的趋势;EcMFE基因在雌、雄虫的头部均具有最高的表达水平;EcFDRs基因分别在雄虫头部与附腺以及雌虫头部与中肠中具有显著地高水平表达;EcCYP4BM1基因在雌、雄虫的中肠表现出最高的表达水平,同时在雄虫的马氏管与附腺中也有较高水平的表达;EcPMP基因在刚结束交尾的雄虫头部及交尾后第9d的雄虫中肠中具有显著地高表达。综合斑蝥素及其合成相关基因在交尾后不同时间中华豆芫菁各组织中的含量与表达情况分析,推测雄虫的脂肪体可能与斑蝥素的合成有关。