鱼类弹状病毒(Fish rhabdovirus)是一类引起鱼类及其它水生动物致死性和流行性病害的病原。鳜鱼弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV)和鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus,SVCV)是本实验室分别从患病的鳜鱼和鲤鱼中分离得虱的两种弹状病毒。本文针对这两种鱼类弹状病毒,开展了DNA疫苗的构建、单克隆抗体的制备及其特性与作用分析等相关研究,主要结果如下:　　 1、鳜鱼弹状病毒(SCRV)DNA疫苗的构建及免疫效果评估　　 在已测定了SCRV全基因组序列的基础上,利用RT-PCR分别扩增出SCRV的G基因和N基因,连接到pMD18-T载体上,转化DH5α菌株后,筛选阳性克隆并扩大培养,提取质粒进行双酶切,将目的片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1上,构建成DNA疫苗。将构建好的DNA疫苗以注射方式对鳜鱼进行免疫,同时设未免疫对照组。通过鱼体攻毒、免疫组化及半定量RT-PCR等方法,对所构建的SCRV G基因和N基因DNA疫苗的免疫保护率、免疫鱼组织细胞病变情况及几个免疫相关基因的表达进行了测试分析。结果显示:(1)SCRV G蛋白DNA疫苗的相对保护率为77.5％；未发病鳜组织的结构基本正常,除肝组织中能检测到微弱病毒阳性信号外,其它组织中未观察到病毒阳性信号；在免疫鱼的肾组织中,免疫相关基因IRF-7、Mx、Viperin不同程度上调表达。(2)SCRV N蛋白DNA疫苗的相对保护率仅为2.5％；IRF-7、Mx、Viperin3种免疫相关基因表达没有明显变化。(3)在SCRVG和N蛋白DNA疫苗的免疫组鱼体肾脏中,炎症因子TNF-α基因表达水平都没有显著变化,但在其注射位点的局部肌肉组织中,显示有不同程度的上调表达。　　 2、鳜鱼弹状病毒(SCRV)单克隆抗体的制备及应用　　 以纯化的SCRV为抗原免疫Balb/c小鼠,采用单克隆抗体技术,经细胞融合、筛选、有限稀释法克隆,共获得了5株分泌抗SCRV单抗的细胞株(2A1、2A3、1B2、2C1和2C3)。对所制备抗体从亚型和识别抗原能力等方面进行了鉴定,并在组织、细胞及分子水平上分别进行了应用。结果表明,在所制备的5株单抗中,1B2为IgG2b,其余均为IgM,且5株单抗均能特异性地识别SCRV的G蛋白。免疫荧光定位显示SCRV的G蛋白呈颗粒状定位于受感染细胞的胞质区域。利用所制备的单抗能捕获到SCRV感染鳜鱼各组织上的相应抗原并显示较强的阳性信号。流式细胞仪分析显示,SCRV感染的鱼类细胞数随着感染时间的增加而呈现倒V字型的变化趋势。此外,建立了SCRV抗原捕获ELISA方法,可检出3.2 ng的SCRV纯抗原或102 TCID50的SCRV感染细胞裂解液。　　 3、鲤春病毒血症病毒(SVCV)单克隆抗体的制备及应用　　 以纯化的SVCV为抗原免疫Balb/c小鼠,运用单克隆抗体技术,筛选、克隆出五株能稳定分泌抗SVCV单克隆抗体的杂交瘤细胞株(1A9、1E10、1H5、1H7和3G4)。对所制备抗体从亚型、中和活性及识别抗原能力等方面进行了鉴定,并在组织、细胞及分子水平上分别进行了应用。结果表明,单抗1A9和1E10为IgG2b,1H7和3G4为IgM,1H5为lgG1；且单抗1A9的细胞培养上清以1:8稀释后仍具有中和1022TCID50SVCV感染的活性。Western blotting分析显示,单抗1E10、1H5和1H7能特异性地识别SVCV的N蛋白；3G4能识别SVCV的G蛋白和N蛋白；1A9则能分别与SVCV的G蛋白、N蛋白及P蛋白起反应。与其他鱼类弹状病毒的间接ELISA结果表明,单抗1H5和1H7能与梭子鱼苗弹状病毒(PFRV)发生交叉反应。利用所制备的单抗能捕获到受感染细胞或组织中的病毒抗原并显示出阳性信号。流式细胞仪分析显示,当以0.01 MOI的SVCV感染鲤鱼上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprini,EPC)细胞28h后,受感染细胞数达到总数的10.12％。　　 由于鲤春病毒血症病毒(SVCV)单克隆抗体的制备及应用研究是在病毒分离鉴定的基础上完成的,因此现将有关SVCV分离鉴定及其G基因克隆、表达等研究内容归纳为本论文摘要的第四部分。　　 4、鲤春病毒血症病毒(SVCV)的分离鉴定及其G基因的克隆表达与定位分析　　 利用细胞培养、电镜观察等技术从患病的鲤鱼中分离鉴定了一株弹状病毒。将过滤除菌后的患病鲤鱼组织匀浆液,接种到不同鱼类细胞后,可引起9种鱼类细胞出现明显的病变。在对病毒进行挑斑分离后,测定该病毒在敏感鱼类细胞(Grass carp fins,GCF)中的滴度达到107.3TCID50/ml；经超速离心提纯该病毒,负染及细胞超薄切片的电镜观察显示,病毒粒子呈现典型的子弹状形态,大小约为90～180 nm×60～90 nm。对该毒株的理化性质进行测定,结果显示该毒株对温度、pH值及有机溶剂氯仿敏感。SDS-PAGE分析显示,该病毒有5种主要蛋白带,其分子量大小分别约为:238 kD、69kD、50 kD、47 kD和28 kD。参照已知弹状病毒核蛋白(N)基因保守区序列,设计一对简并引物,通过RT-PCR的方法成功扩增得到大小约为626 bp的DNA片段。序列分析显示,该病毒株与SVCV A2株在N蛋白氨基酸序列上的相似性达到97％,证实该新分离的病毒株为SVCV。　　 利用RT-PCR从SVCV基因组中克隆了G基因的全部编码区,成功构建了重组表达载体,进行了原核表达,并在EPC细胞中进行了亚细胞定位。序列分析表明,SVCVG基因的ORF全长为1530bp,编码一个长为509aa,分子量大小为57.6 kDa的推定蛋白。前18个氨基酸可能是G蛋白的信号肽,而第468-487位氨基酸可能是G蛋白的跨膜区。系统发育树分析结果表明,新分离到的SVCV与国内其他9个分离株、美国6个分离株及英国在1998年分离的980451株、980528株、970469株在系统发育树上的进化方向一致,同属于Ia基因亚型,而与其它SVCV毒株在进化方向上有明显的差异。重组原核表达质粒pET32a-G转化表达宿主菌后诱导表达,获得一条约66kDa的融合蛋白,并进一步制备了融合G蛋白的抗体。Western blotting分析显示,所制备的抗体能够特异性地识别SVCV的G蛋白；免疫荧光定位显示,SVCV G蛋白呈颗粒状定位于受感染细胞的胞质区域。