第一部分：酵母双杂交筛选TM4相互作用蛋白　　目的：应用酵母双杂交技术筛选与TM4蛋白存在相互作用的蛋白。　　方法：以Clontech公司提供的说明为基准：(1)PCR得到TM4基因ORF全长，构建重组酵母质粒pGB-TM4，测序验证插入片段序列和读码框的正确性；(2)检测TM4蛋白是否具有自激活报告基因的能力及细胞毒性；(3)顺序转化pGB-TM4诱饵质粒和胎脑cDNA文库或含1500个全长基因的cDNA文库至酵母AH109细胞并使其在三缺陷培养板上生长，挑取克隆，利用x-α-gal检测这些克隆是否表达LacZ报告基因鉴定阳性克隆，进一步扩增阳性克隆，提取质粒，测序得到阳性克隆序列，数据库序列比对明确基因。　　结果：构建pGB-TM4诱饵质粒成功，且质粒没有自激活报告基因的能力同时对酵母细胞生长没有明显毒性作用。通过对2个文库转化获得的克隆，得到31个阳性克隆，经测序及blastn比对证实其中5个为NR4A1基因，8个为RNF-5，2个为USP-19，其余为ST7L、SEC22C等，共获得8种潜在相互作用蛋白。　　结论：应用酵母双杂交技术筛选到8种TM4可能相互作用蛋白，包括孤核受体家族蛋白、泛素化相关蛋白、其他功能尚不清楚的蛋白，为进一步的深入研究TM4。　　第二部分：TM4对Nur77及其对下游分子IKK调控作用的研究　　目的：运用免疫沉淀和pulldown实验证实Nur77与TM4存在相互作用；运用RNAi技术研究TM4对相互作用蛋白Nur77及其下游蛋白的调控作用；研究高糖、高脂对TM4的表达的影响作用。　　方法：(1)免疫沉淀：构建Nur77过表达真核表达质粒，转染293细胞，提取细胞总蛋白，运用protein A/G-Nur77特异性抗体捕获Nur77-TM4复合体，再使用TM4抗体检测。(2)Pulldown：构建6xhis-tag的Nur77原核表达载体，表达Nur77，运用镍柱纯化Nur77蛋白；同时构建Flag-M4和EGFP-TM4过表达载体，转染293细胞，提取细胞总蛋白，将his-Nur77蛋白与过表达Flag-TM4或EGFP-TM4的细胞裂解产物分别反应，用beads沉淀复合物，western blot检测Flag-TM4和EGFP-TM4。(3)设计合成TM4-siRNA片段，干扰TM4表达，运用PCR及westernblot检测TM4、Nur77及IKKB的表达及蛋白水平。(4)构建TM4-shRNA干扰慢病毒载体，进一步验证相关蛋白的表达变化。(5)高糖、高脂刺激细胞，western blot检测TM4表达水平。　　结果：免疫沉淀可以检测到TM4；pulldown检测到flag-TM4和EGFP-TM4；获得有效干扰TM4表达的小RNA及sh-RNA，成功获得TM4干扰慢病毒；干扰TM4可以显著上调Nur77的蛋白水平，同时上调Nur77下游靶蛋白IKKβ的表达；高脂可以显著下调TM4的表达，而高糖不能。　　结论：TM4与Nur77之间存在相互作用；TM4对Nur77存在调控，并通过Nur77调节下游IKKβ表达，进而可参与炎症过程；高脂可抑制TM4表达。　　第三部分：TM4基因剔除小鼠表型观察　　目的：研究TM4基因剔除可能出现的表型，阐明TM4的生理功能。　　方法：(1)运用软龙公司(softron公司)小鼠血压仪检测TM4基因剔除小鼠血压；(2)运用高热量饮食喂食正常、TM4基因剔除小鼠，观察小鼠肥胖的发生、发展的速度和肥胖的严重程度；(3)OGTT检测TM4基因剔除小鼠糖耐量和血糖水平。　　结果：(1)检测到TM4基因剔除小鼠模型血压增高；(2)TM4基因剔除小鼠糖耐量异常，血糖水平显著高于正常小鼠；(3)TM4基因剔除小鼠在高热量饮食诱导后，与正常小鼠相比体重显著增加，并出现明显的肥胖表型。　　结论：TM4参与机体血糖的调节和肥胖的发生及血压的调控，且这些作用与Nur77-IKK高度相关。