目的：抗体的糖型对抗体的功能有着极其重要的影响，PNGase F和Endo F2是糖苷酶家族中的重要成员，在抗体和抗体糖型的鉴定中发挥着重要作用，但这两种酶的酶切最适pH值差异巨大，无法在同一pH的缓冲液下进行抗体单步酶切，并且PNGase F无法切除位于抗体Fab段的糖链。若抗体在多个部分有糖基化修饰，那么就要两种酶进行多步酶切，而这会对后期抗体及其糖型的检测造成不可控的影响，如何在同一pH下使两种酶均能发挥作用目前尚未有研究。方法：分别通过全基因合成得到PNGase F及Endo F2基因片段，采用大肠杆菌进行表达，纯化过后得到了PNGase F及Endo F2，然后通过晶体模拟及蛋白参数的运算，决定采用融合蛋白的方式来完成Endo F2的pH shift，确定了通过串联两段基因进行表达的可行性，将Endo F2及PNGase F基因串联片段克隆到pET32a+载体上，并诱导大肠杆菌表达获得大量重组可溶性的糖苷酶，进而采用两步纯化，得到具有活性的高纯度“融合酶”。采用该酶进行抗体酶切，并通过质谱及SDS-PAGE来进一步确定“融合酶”pH shift的有效性。结果：通过串联表达构建的“融合酶”不但实现了可溶性表达，可以应用于宽泛的pH范围，可在同一pH缓冲液中同时发挥两种酶的作用，并且可以在非变性的条件下有效地切除抗体中FC及Fba上的糖链，具有很好的脱糖基的作用。结论： Endo F2和PNGase F融合表达后，形成了一种新型双功能酶，成功地实现了pH shift。该“融合酶”可在同一pH下良好的发挥相应作用。很好的解决了当抗体中有多个糖基化位点时的酶切鉴定问题。