研究目的:1、观察并比较人小肠各段潘氏细胞的分布，形态结构特点。分析与其功能之间的关系。 2、通过透射电子显微镜展示处于不同分泌时相的人小肠潘氏细胞的超微结构等形态学特点。 3、观察并分析潘氏细胞脱颗粒与小肠黏膜上皮细胞增殖状态之间的关系。实验方法 一、材料和方法:1、1实验标本选取及分组：取自中山大学附属第二医院2005年3月至2005年10月间，胃肠胰外科病人手术切除的小肠标本共24例，其中包括十二指肠8例，空肠8例，回肠8例。8例十二指肠标本及8例空肠标本来源于5位男性(平均年龄51.8±8.0岁)，3位女性(平均年龄53.6±11.0岁)，病种包括胃、十二指肠肠良性溃疡4例，早期胃癌4例，均行毕Ⅱ式胃-空肠吻合，分别取十二指肠残端及距离Tris韧带15-20cm处的空肠黏膜一小块。8例回肠标本来源于6位男性(平均年龄55.6±12.0岁)，2位女性(分别61，53岁)，手术病种包括升结肠癌4例，升结肠多发性憩室1例，均行右半结肠切除术；因直肠癌行预防性回肠造口后，回肠末端关瘘术3例；分别取距离回盲部10-15cm的末端回肠或回肠造瘘口近端黏膜各一小块.所有标本经病理学检查证实为正常小肠黏膜组织.三组患者在年龄和性别分布、疾病构成，分期及有无其它共患病等方面差异无显著性。排除激素，免疫抑制剂等药物及炎症性肠病等疾病因素的影响，所有患者术前未接受过放疗、化疗及抗生素治疗。 1、2标本处理标本切除后立即投入液氮中，后转移至-80℃冰箱冷冻保存直至使用。取所存标本经冷生理盐水漂洗5分钟后，10％中性福尔马林溶液固定24小时以上，脱水，然后行常规石蜡包埋。制成3-5um石蜡切片后，苏木素—伊红(HE)染色，行常规病理组织学检查和增殖细胞核抗原(PCNA)、溶菌酶(Lysozyme)免疫组化染色检测。 1、3人小肠黏膜潘氏细胞(PCs)及人回肠上皮增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化染色人小肠黏膜潘氏细胞(PCs)染色采用溶菌酶免疫组化染色方法。免疫组化试剂盒均购自福建迈新生物技术有限公司。石蜡包埋的组织块在切片机上行3～5μm切片；常规脱蜡，梯度乙醇水化：磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH7.4)冲洗3次，每次5分钟(下同)；微波热修复抗原30分钟，每张切片加50ul过氧化酶阻断溶液，室温孵育10分钟；PBS冲洗3次；加50ul的正常非免疫动物血清，室温孵育10分钟，倾去血清，勿洗；加50ul的Lysozyme多克隆抗体或PCNA单抗，4℃下孵育过夜；PBS洗3次；加50ul生物素标记的第二抗体(试剂C，黄色液体)，室温下孵育30分钟；PBS洗3次；加50ul链霉素抗生物素-过氧化酶溶液，室温下孵育30分钟；PBS洗3次；每张切片100ul新鲜配制的DAB溶液，显色3-10分钟；自来水充分冲洗10分钟；苏木素复染2分钟；PBS或自来水冲洗返蓝；梯度酒精脱水干燥；透明；中性树胶封固。用PBS代替一抗作为阴性对照，以淋巴瘤组织作为PCNA阳性对照。 1、4人小肠潘氏细胞计数及回肠黏膜上皮细胞PCNA增殖指数检测在普通光镜下观察十二指肠，空肠，回肠PCs的形态、结构特点、分泌颗粒的染色情况及分段细胞记数； 溶菌酶阳性的潘氏细胞计数(x±s)：10×40视野下观察，按确定的方向依次计数10个结构显示良好，染色清晰的隐窝腔，计算其中LZM染色阳性PCs数量，总数即为每10个隐窝LZM染色阳性的PCs数，每组大鼠可得8个数值。，计量资料以x±SD表示。 细胞核着棕黄色判定为PCNA阳性染色细胞，每张回肠PCNA染色切片随机选择5个高倍视野，每个视野选择3条绒毛，计数每条绒毛中阳性细胞数和总细胞数，PCNA指数=阳性细胞数/总细胞数×100％。 1、5人小肠潘氏细胞颗粒分泌状态分析采用KontronIBAS2.0全自动图像分析系统，在40×10倍视野下观察，每张回肠潘氏细胞Lysozyme免疫组化切片随机选取5个视野，测算每一测试区域的灰度级GA和面积(m+n)、阳性反应产物的灰度级Gα和面积n(或背景面积m)。测试仪器最大灰度分级(Gmax)为256。应用免疫组织化学定量计算公式：PU=100×|Ga-GA|/Gmax×[1-(n/m+n)]，导出阳性单位(PU)数值，每张切片均可得出一平均PU值，其数值大小即可说明潘氏细胞颗粒含量的多少。并进一步分析潘氏细胞的颗粒分泌状态与小肠黏膜上皮细胞增殖之间的关系。 1、6透射电镜下人回肠潘氏细胞超微结构特点另取回肠1mm×1mm×2mm大小的组织块置2.5％戊二醛中固定，透射电镜下观察不同分泌时期PCs超微结构特征。 二、检测指标：1、光镜下观察人小肠各段潘氏细胞的形态结构特征及分布。 2、透视电镜下观察不同状态下人潘氏细胞的超微结构特征。 3、人回肠黏膜上皮细胞PCNA增殖指数的检测。 4、图像分析系统对潘氏细胞颗粒进行定量分析，并分析潘氏细胞脱颗粒与小肠黏膜上皮细胞的增殖及多能干细胞之间的关系。 三、统计学处理：计量资料采用t检验，多组的PCs计数采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验，相关性用Spearman等级相关检验；P＜0.05为差异有显著性，P＜0.01为差异有明显显著性。上述检验均采用SAS8.1版本统计软件包在电脑上运行。 结论:1、在一般情况下，人小肠潘氏细胞仅存在于小肠，由十二指肠向下至空肠，回肠，细胞数量呈递增分布。人结肠中未见有潘氏细胞。 2、人潘氏细胞位于小肠黏膜隐窝的基底部，呈簇状分布，细胞形态为锥形柱状，细胞核位于细胞基底部，其胞质中含有一定数量的分泌颗粒，分泌颗粒溶菌酶染色为阳性。 3、透射电镜下见人小肠潘氏细胞具有肠内分泌细胞超微结构特征。处于分泌期的潘氏细胞细胞器结构表现出粗面内质网的扩张和发达的高尔基体，线粒体明显肿胀，脱颗粒后潘氏细胞核上胞质中出现空泡样变。但细胞核没有显示凋亡改变，潘氏细胞脱颗粒是一主动过程，颗粒分泌与否并不是由于细胞的凋亡引起。 4、人潘氏细胞颗粒分泌与小肠黏膜细胞的增殖状态有关，反映在潘氏细胞脱颗粒时，其小肠黏膜增殖细胞核抗原(PCNA)指数增高。PCNA指数在一定程度上可以反应肠上皮干细胞的增殖状态，检测PCNA指数变化即反应肠黏膜上皮损伤修复状况。 5、鉴于人潘氏细胞在小肠黏膜隐窝中所处的位置及其与小肠黏膜细胞增殖状态相互关系，提示潘氏细胞对于维护肠黏膜屏障功能的完整性，启动小肠黏膜上皮细胞的增殖、受损肠黏膜屏障的修复等具有重要的生理学意义。对位于隐窝的细胞，尤其是肠上皮干细胞具有重要的保护作用。