伴随工业水平的进步和生活水平的提高,不良的生活环境、不健康的饮食习惯和日益增加的生存压力等导致育龄夫妇的精子与卵子质量急速下降,不孕不育已成为威胁生殖健康的一个重要问题。当胚胎发育至第7天,人胚胎需植入母体的子宫中才能继续存活和发育。这个阶段胚胎在子宫体内发生的变化以及导致这些变化的关键细胞和分子事件,由于材料的无法获得以及缺乏相应技术导致这些问题仍处在黑匣子状态。胚胎植入失败以及在此阶段的发育异常是导致早期流产的主要原因。因此,对人胚胎原肠前发育过程的研究将为我们理解生命起源、探索早期胚胎发育动态变化过程和分子调控机制提供重要的理论依据。2016年的两篇报道在小鼠胚胎体外培养的基础上,建立了着床后人胚胎体外2D培养体系,该体系能够将胚胎在体外培养至13天,并观察到一些谱系分离的现象。然而2D条件下胚胎存在一些重要缺陷,如2D培养的胚胎是扁平的,缺乏体内3D的拓扑结构;虽然2D培养胚胎的滋养外胚层12天后仍在继续存活,但整个胚胎结构发生了坍塌和出现了发育的紊乱,导致很多细胞类型(羊膜上皮)、腔(羊膜腔、卵黄囊)和结构(基底膜、前后轴、原条)无法在2D培养的胚胎中清楚地观测到。因此,这些缺陷限制了2D体系很难真正模拟体内胚胎的发育,无法揭示胚胎在该阶段的发育事件和机制。为了克服以上这些缺陷,我们开展了本论文的研究。我们在获得严格的伦理允许和病人知情同意的条件下,利用临床上捐献的胚胎,通过改善培养基和培养方法,开发了一个三维(3D)人囊胚培养体系,并采用该体系首次将人囊胚在3D条件下培养到原条原基阶段。这些3D胚胎能高度地模拟体内胚胎的发育,经历不同形态的发育并自发组装成2D条件下无法产生的3D结构,包括胚胎双层胚盘、羊膜(amnion)、基底膜(basal membrane)、初级和灵长类独特的次级卵黄囊、前后轴和原条前体。利用这个体系,我们揭示了人原肠前胚胎的关键发育事件:(1)通过单细胞转录表达谱的分析,揭示了上胚层细胞、下胚层细胞和滋养层细胞谱系分化和发育的动态和分子调控网络。(2)羊膜上皮细胞(AME)是上胚层细胞分离出来的第一类细胞系,不同于啮齿类动物,人AME发生于原条形成之前,但其特性和分子机制不清楚。我们发现:与上胚层细胞相比,AME显著地下调多能性基因,其形成与基底膜的缺失显著相关,并有独特的分子表达谱。(3)首次阐明细胞滋养层(cytotrophoblast)、绒毛外细胞滋养层(extravillous cytotrophoblast)和合胞体滋养细胞(syncytiotrophoblast)在胚胎着床后的分化以及引起分化的信号和转录因子,揭示了绒毛外细胞滋养层在早期胚胎中不同于中、后期胎盘的功能。(4)揭示了上胚层细胞(PSCs,多能干细胞)着床后将很快从naive到primed状态的转变。PSCs从着床至第14天期间保持相对的稳定状态,而其发育和转化是由不同的多能因子协调作用所决定的。(5)通过人和非人灵长类胚胎的转录组分析,发现非人灵长类和人上胚层细胞在代谢上具有明显差异,而在维持干细胞多能性以及发育的关键分子和信号通路上具有保守性。本论文利用独创的人胚胎体外3D培养体系详细阐述了胚胎在发育过程中谱系的分离、羊膜腔的形成、羊膜上皮的分离、卵黄囊的形成、胚胎极性的产生和原条的形成等发育学事件。本论文回答了EPI多能性的维持和转化、羊膜上皮的形成机制、滋养层分化发育的机制等科学问题。本研究成果为胚胎的早期发育和干细胞的相关研究提供了新的模型,为组织再生和器官再生提供了研究的理论基础,为研究胚胎因素的着床失败和早期流产提供了理论支持,为不孕症治疗和辅助生殖技术中现存问题的解决提供了研究思路和研究方向。