IP3R2蛋白结构域对鸭蛋壳品质的效应机理研究

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禽蛋壳破损会导致禽蛋生产行业的经济损失。蛋壳矿化是一个涉及碳酸钙沉淀的复杂过程,是碳酸钙与有机基质在成核和生长阶段相互作用的结果。肌醇1,4,5-三磷酸(IP3)受体(IP3R)2型(IP3R2)是内质网(ER)上的Ca2+释放通道,调控内质网Ca2+释放。但目前对IP3R2基因的功能以及该基因在禽类中对蛋壳品质调控效应知之甚少。因此,本研究利用RT-qPCR、PCR扩增直接测序法、基因克隆、ELISA、Fluo-3/AM钙离子荧光标记法和酶标仪等方法开展了:IP3R2基因在三穗鸭产蛋高峰期的组织表达谱以及IP3R2基因SNPs与蛋壳品质的影响、IP3R2基因蛋白结构域对鸭子宫上皮细胞Ca2+调控效应、IP3R2基因蛋白结构域过表达与子宫上皮细胞中20个阴阳离子转运相关基因m RNA表达水平的影响等研究工作。本文主要结果如下:1.RT-qPCR检测结果显示IP3R2 mRNA在45周龄三穗鸭11个组织中均有不同程度表达,表达量依次为胰腺>子宫>腺胃>肾>胸肌>脾>小肠>肺>肝>心脏>肌胃。PCR扩增直接测序法在IP3R2基因外显子16发现g.128662092 C>T突变、内含子14发现g.128659402 G>T突变和内含子37发现g.128767757 A>G突变,g.128662092 C>T对蛋壳强度有显著影响(P<0.05),TT基因型对增加蛋壳强度有利;3个SNPs联合产生4种单倍型和10种双倍型,双倍型H3H3、H4H4和H1H2个体的蛋形指数显著高于双倍型H2H2(P<0.05),双倍型H1H1和H1H2个体的蛋壳厚度显著高于双倍型H2H2(P<0.05),双倍型H1H1、H1H2和H1H3个体的蛋壳强度显著高于双倍型H3H4和H4H4(P<0.05),表明新发现的3个SNPs联合对蛋形指数、蛋壳厚度和蛋壳强度有显著效应,可能作为鸭蛋壳品质选择的遗传标记。2.试验成功构建IP3R2基因蛋白结构域MIR、RYDR_ITPR(1)、RYDR_ITPR(2)、RIH_assoc和Ion_trans序列的pc DNA3.1+Flag表达载体,转染鸭原代子宫上皮细胞,Flag标签检测试剂盒(ELISA)和钙荧光探针(Fura-3/AM)分别检测IP3R2基因5个结构域过表达量和胞内Ca2+浓度,结果显示:MIR、RYDR_ITPR(1)、RYDR_ITPR(2)、RIH_assoc和Ion_trans结构域过表达均引起鸭子宫上皮细胞内Ca2+浓度下降;RYDR_ITPR(1)、RYDR_ITPR(2)、RIH_assoc和Ion_trans结构域表达量与胞内Ca2+浓度均达显著负相关水平(P<0.05),RYDR_ITPR(2)结构域对鸭子宫上皮细胞内Ca2+调控效应最强,结果揭示IP3R2基因5蛋白结构域的过表达将会引起鸭子宫上皮细胞内Ca2+向胞外释放。3.RT-qPCR检测IP3R2蛋白结构域过表达对鸭子宫上皮细胞中20个离子转运基因m RNA表达水平,结果显示:MIR结构域过表达量与IP3R1、CALB1和CA2 m RNA表达量呈现显著正相关(P<0.05);2个RYDR_ITPR结构域过表达量均与KCNJ15、RYR2和CA2表达量呈现显著正相关(P<0.05);RIH_assoc结构域过表达量与IP3R2和ORAI1基因表达量呈现显著正相关(P<0.05);Ion_trans结构域过表达量与CALB1、SLC8A1和CA2基因表达量呈现显著正相关(P<0.05);5个结构域共转后的表达量与CFTR基因表达量呈现显著正相关、与TRPV6呈现显著负相关(P<0.05),表明IP3R2基因5个蛋白结构域的过表达对鸭子宫上皮细胞中20个离子转运基因m RNA表达水平的调控效应存在差异。4.通过分析IP3R2基因5个蛋白结构域在鸭子宫上皮细胞中过表达后胞内20个离子转运基因m RNA表达水平的相关性,结果显示:未转染组IP3R2基因表达量与IP3R3、RYR2、SLC4A4、SLC4A9和ATP2B1基因表达量显著正相关(P<0.05);RYDR_ITPR(1)结构域过表达IP3R2基因表达量与TRPV6表达量显著负相关(P<0.05);RYDR_ITPR(2)结构域过表达IP3R2与CALB1和RYR2表达量显著正相关(P<0.05);RIH_assoc结构域过表达IP3R2基因与ORAI1基因表达量显著正相关;Ion_trans结构域过表达IP3R2与KCNJ15基因表达量正相关(P<0.05);5个结构域过表达IP3R2与CALB1、SLC8A1、CA2和SLC4A9基因之间的表达量显著正相关,与RYR2基因表达量显著负相关(P<0.05)。表明IP3R2基因5蛋白结构域在鸭子宫上皮细胞中过表达后会改变检测的胞内20个离子转运基因m RNA表达水平相关系数,进一步揭示IP3R2基因5蛋白结构域的过表达调控鸭子宫上皮细胞内Ca2+向胞外释放的机制存在差异。
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