研究背景：激素性股骨头缺血性坏死(steroid induced avascular necrosis of the femoral head, SANFH)是最常见的非创伤性股骨头坏死,同样也是ANFH中最难治疗的一种类型。当股骨头坏死进展到塌陷期时,手术可能将成为唯一有效的治疗方法。对于早期SANFH,目前国内外尚无理想的治疗方案。近年来,国内外学者已经对糖皮质激素引起股骨头缺血坏死的发生机制,进行了许多比较深入的研究,并且提出了众多学说来解释,如二次碰撞学说、骨质疏松学说、脂质代谢紊乱及凝血状态增强学说、氧化应激及微血管损伤学说、细胞凋亡学说等。然而并没有哪一种单一的学说能够很好的解释骨坏死发生的整个病理过程。因此,SANFH的发病机制仍有待进一步地研究和探讨。近年来,有学者认为糖皮质激素作用于骨髓间充质干细胞导致其分化、代谢的异常是激素性骨坏死的主要发病机制之一,但仍需要进一步的大量研究证实。自从20世纪50年代发现了骨的压电效应之后,人们就开始关注于对骨组织的生物电性质的研究。电磁场的应用在临床上就逐渐开展起来。目前,脉冲电磁场(pulsed electromagnetic fields, PEMF)已经较为广泛地应用关节炎、骨不连、骨质疏松等骨科系统疾病的治疗中,目前,LF-PEMF应用于治疗SANFH尚处于试验阶段,尚未在临床上广泛应用。其对于骨折及骨质疏松的治疗效果肯定,但对于SANFH的治疗仍需要更进一步的研究,以明确其具体的作用机制及最佳的治疗方案。在本部分研究中,我们希望通过动物及细胞实验,进一步研究SANFH的发病机制,并探讨LF-PEMF对早期激素性股骨头坏死的治疗作用及机理。第一部分：激素性股骨头缺血坏死大鼠模型的建立和发病机制的探讨目的：建立激素性股骨头坏死的动物模型,并探讨该疾病可能的发病机制；方法：将36只Wistar大鼠(255±13g)随机分为实验组及对照组,每组各18只：(1)模型组：每只Wistar大鼠接受10Mg/kg的大肠杆菌内毒素(LPS)尾静脉注射；然后每隔24h于大鼠臀部肌肉注射20mg/kg甲基泼尼松龙1次,共3次,两侧臀部交换注射。(2)对照组：在对照组注射药物相同的时间点,采用相同的注射方式给予相同剂量的无菌生理盐水。于激素注射后24小时(24h),2周(2w)及4周(4w)三个时间点分别处死6只大鼠,取材检测相关指标：全自动生化分析仪检测血脂变化；HE及Masson染色观察组织病理学改变；PCR检测股骨内PPAR-γ2及Runx2mRNA的表达。结果：HE染色可见正常对照组造模后24h,2w,4w,大鼠股骨头病理改变基本一致,没有显著差异。在模型组中,造模后24h股骨头与正常对照组病理改变一致；造模2w后,股骨头软骨下骨骨小梁内出现较多空骨陷窝,骨髓内造血细胞减少,脂肪细胞增多,形态改变并出现融合现象；造模后4w,83%(5/6)大鼠股骨头内出现典型的骨坏死区域,软骨下骨结构出现破坏,骨小梁内可见广泛的空骨陷窝,骨髓内出现大量坏死的细胞碎片。在模型组中,血脂在造模后24h开始升高,2w时增高最明显,4W时血脂有所下降,仍异常升高,而对照组血脂无明显改变。Masson染色观察显示正常组股骨头内,以成熟的骨组织为主；模型组中出现较多不成熟的新生骨；RT-PCR结果显示模型组PPAR-γ2mRNA在2W、4w时逐渐升高,而Runx2则逐渐降低,与正常对照组相比,差异有统计学差异。结论：(1)采用激素联合单次剂量脂多糖的方法,能够成功地建立早期激素性股骨头坏死的大鼠模型；(2)PPAR-γ2及Runx2在股骨头坏死的发生及进展中发挥着重要的作用。大剂量激素的应用能够上调股骨头组织内PPAR-γ2的表达,下调成Runx2的表达,导致骨股骨头组织内骨生成及脂肪生成平衡的破坏,引起脂质代谢紊乱及骨形成的抑制,并最终导致股骨头坏死的发生。第二部分：LF-PEMF对早期SANFH的治疗作用及机理研究目的：在第一部分激素性股骨头坏死的模型基础上,进一步探讨LF-PEMF对早期SANFH的治疗的作用及机理。方法：将42只Wistar大鼠(250±11g)随机分为三组,(1)模型组(S,n=16)：造模后不给予磁场处理；(2)LF-PEMF治疗组(S+P,n=16)：造模4周后,给予LF-PEMF (4.5ms,15Hz,1.2mT),4h/天,共治疗8周；(3)空白对照组(C,n=10)：不造模,也不给予LF-PEMF治疗。造模方式同第一部分。LF-PEMF治疗8周后,处死所有动物,行HE及Masson染色观察组织病理学改变,通过PCR及Western检测PPAR-γ2及Runx2的表达。结果：与S组相比,S+P组中的大鼠股骨头坏死的发病率(31%vs.69%)及空骨陷窝率(36.16±15.34vs.59.55±21.70)更低。S+P组股骨头组织内PPAR-γ2表达的水平比S组显著降低,而Runx2的表达则明显高于S组。结论：(1)再次证实糖皮质激素能够导致股骨头组织内脂肪生成及骨形成之间的失平衡,最终导致股骨头坏死的发生。(2)LF-PEMF是一种无创、安全而有效的治疗早期激素性股骨头坏死方法,其可能的作用机制是LF-PEMF能下调早期SANFH大鼠股骨头组织内PPAR-γ2mRNA及蛋白的表达,上调Runx2mRNA及蛋白的表达,在一定程度上纠正激素导致的脂肪生成和骨形成之间的失平衡状况,促进骨形成,降低骨坏死率。第三部分：LF-PEMF对激素诱导BMSCs成脂分化作用机制的探讨目的：通过细胞实验进一步探讨激素性股骨头坏死的发病机制及LF-PEMF治疗该疾病的机理。方法：用贴壁法体外分离培养Wistar大鼠BMSCs,定期观察细胞生长状况,MTT法绘制P1,P3及P6BMSCs的生长曲线,并通过成骨、成脂分化诱导及流式细胞仪检测来鉴定；取生长良好的P3代细胞进行后续试验,随机分为4组,对照组(C)：完全培养基培养换液,不给予LF-PEMF治疗；LF-PEMF治疗组(P)：完全培养基培养换液,并进行LF-PEMF治疗,2h/天,共7天；成脂分化诱导组(S)：给予高糖完全DMEM培养基换液,同时加入终浓度为1×10-6mol/L地塞米松,换液的同时,保证维持激素的浓度LF-PEMF+成脂分化诱导组(P+S)：在S组的基础上,进行LF-PEMF干预,2h/天,共7天。7天后,收集细胞,检测细胞内甘油三酯及.ALP的含量,通过RT-PCR检测PPAR-γ2和Runx2mRNA的表达。结果：(1)经过反复贴壁法培养的细胞具有良好的贴壁性能,生长曲线显示随着细胞代数的增加,细胞有逐渐衰减的趋势；P3代细胞成骨分化诱导液培养后行茜素红染色可见红色钙化结节,成脂肪细胞培养基诱导培养2周后行油红“0"染色,可见脂滴形成；(2)各种因素干预7天后检测：S组细胞内PPAR-γ2mRNA的表达量及TG水平明显高于其他各组,而Runx2mRNA的表达量及ALP水平则要明显低于各组。结论：(1)本实验所采用的方法能够很好的从大鼠的股骨髓内获取BMSCs,且细胞纯度比较高；(2)大剂量激素能够诱导体外培养的BMSCs向成脂肪分化,减少成骨分化,导致BMSCs正常分化平衡的破坏,导致脂肪生成增多,骨形成减少。激素导致的BMSCs分化、代谢的失平衡是激素性股骨头坏死的重要发病机制之一。(3)细胞实验证实了LF-PEMF改善大剂量激素引起的BMSCs成脂分化与成脂肪分化的失平衡状态,减少脂肪生成,增加骨形成及修复,从而达到治疗早期股骨头缺血坏死治疗目的。