研究背景 绿脓杆菌（PA）是创伤和免疫机能低下患者最易感染的病原菌之一，在烧伤感染中其检出率居首位，耐药谱广，致死亡率高，故一直是烧伤界极为重视的病原菌。已发现的PA毒力因子有十余种，如外毒素A（PEA）、内毒素（LPS）、胞外酶S、溶血物质、蛋白酶和杀白细胞素等，其中PEA为该菌毒力最强的毒力因子。20世纪60年代，Liu.P.V.首先发现PEA，并进行了纯化和鉴定，指出约90％的PA临床分离株可以产生PEA。PEA在细菌的衰亡期以酶前体的形式分泌，由613个氨基酸组成，具有对多种培养细胞的毒性和动物的致死作用，毒力是LPS的1万倍。在既后的研究中人们发现，PEA对宿主的损伤效应远远不止抑制细胞蛋白质合成的直接毒性作用，还可以引起中性粒细胞（GRAN）数目减少和杀菌力下降，抑制粒细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞的增殖，削弱机体的免疫系统，具有免疫抑制和诱导细胞凋亡的多种非直接细胞损伤机制，引起多脏器的组织坏死和功能损伤。因此，PEA在PA脓毒症中致死作用的研究日益受到重视。实验中发现，血中PEA水平与肿瘤坏死因子α（TNFα）及白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）等前炎性细胞因子的水平有密切关系，与LPS共同影响脓毒症患者全身炎症反应和多脏器功能障碍综合症（MODS）的发生和发展。临床观察中也发现，PA感染患者体内PEA抗体水平与患者的病情密切相关，体内PEA抗体水平高者，其病情较轻、存活率明显升高。因此，研究PEA对烧伤动物模型的损伤效应和PEA抗体的保护作用具有重要的临床意义和应用前景。研究目的 对于大多数G菌来说，最重要和研究最多的毒力因子是LPS，而对于PA来说，除LPS外，PEA的直接细胞毒性、诱导细胞凋亡和削弱机体免疫力的毒性作用，及PEA与LPS的协同作用在PA脓毒性休克、全身炎症反应综合症（SIRS）和多脏器 第二军医大学 中文摘要 硕士学位论文 功能障碍综合症（MODS）的发生和发展中不容忽视。本研究通过对PEA引起的严 重烧伤大鼠循环血免疫细胞数量和组成变化、前炎性细胞因子 hFa和 IL－la水平 改变及脏器功能损伤的研究，探讨PEA对严重烧伤大鼠的损伤效应和可能机制。 研究方法 一．实验动物模型的制备和研究：严重烧伤Q0皿ll”烧伤）大鼠尾静脉注射 4us／200sBW、10us／200sBW和 20us／200gBW三个不同剂量的 PEA溶液，每 6 ’J’时 观察动物的精神状态和死亡率，探索PEA引起严重烧伤大鼠脏器损伤至死亡的可 能剂量范围，并确定PEA引起严重烧伤大鼠PEA毒血症脏器损伤模型的有效剂量， 制备PEA引起实验动物损伤效应的毒血症模型。 二．陀A对外周血免疫细胞数量和组成的影响：严重烧伤大鼠尾静脉注射 10Ug／200叨w的PEA溶液后1，3，6，12和24小时5个时相点，取抗凝血进行 白细胞（hC）、淋巴细胞 （LY）和中性粒细胞（GRAN）计数，并计算 LYM与 GRAN 的比值几／G），研究在体情况下 PEA对机体的整体免疫功能影响。 三．PEA对循环血内前炎性细胞因子水平的影响：ELISA法检测PEA作用的 不同时相点，循环血中前炎性细胞因子hF a和几－l。水平的改变，通过免疫组 织化学方法显示备主要脏器内 INF a的靶位和半定量研究组织内 TNF a表达水 平。 四．PEA对重要脏器功能的影响：通过光镜、透射电镜等病理学诊断手段， 和血中肝功能酶谱生化检测方法，观察PEA对重要脏器在细胞和亚细胞水平上的 损伤效应。 五．PEA抗体对PEA损伤的保护作用：将实验动物进行PEA抗体主动兔疫， 观察其对PEA的免疫抑制、前炎性细胞因子水平改变和脏器功能损伤的保护作用。 结果 一．第一部分 实验动物模型的制备和研究 一次性注射10ug／200gBW的PEA给严重烧伤大鼠和20ug／200gBW以上的PEA 给假烫动物，均可引起实验动物的急性死亡。4fig／200gBW的PEA剂量不能引起两 组动物48小时内死亡，对假烫鼠的精神状态无明显影响。选择10 fig乃00gBW的 PEA剂量研究 PEA弓起的急性损伤效应，4 Llg／200gBW的 PEA剂量用于研究 PEA弓 3 第二军医大学 中文摘要 硕士学位论文 起的慢性损伤效应，制备正常和烧伤大鼠PEA损伤效应的毒血症模型。 二．第二部分PEA对严重烧伤大鼠损伤效应的实验研究