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第一部分 miR-19a-3p、miR-17-3p和miR-18b-5p与ESCC淋巴结转移的相关性研究背景与目的近年来随着人们生活水平的提高及健康意识的增长,食管癌（esophagealcancer,EC）的发病率有所下降,但死亡率居高不下。据统计,2020年全球食管癌的癌症发病率排名下降到第7位、死亡率保持第6位。食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）是我国食管癌的主要组织学亚型,占EC患者的近90%。ESCC是一种高侵袭性和致死性肿瘤,治愈率较低,治疗失败的主要原因是局部侵袭和淋巴转移,其中区域淋巴结转移（lymph node metastasis,LNM）是食管癌最主要的转移方式,且在不同的患者之间有很大的差异。因此寻找与淋巴结转移相关的分子标志物变得尤为重要。许多研究表明微小核糖核酸（ribonucleicacid,RNA）参与了食管癌的侵袭和转移,也与淋巴结转移相关。论文第一部分的研究主要是根据ESCC淋巴结转移的差异,应用微小RNA（microRNA,miRNA）微阵列分析筛选及定量逆转录-聚合酶链反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR）验证,得到与淋巴结转移密切相关的肿瘤特异性miRNAs。方法收集58例ESCC患者肿瘤样本,选择4例LNM和4例无淋巴结转移（non lymph node metastasis,NLNM）的ESCC组织进行miRNA微阵列分析,筛选出两组间显著差异的miRNAs,然后在另外50例ESCC组织样本中利用qRT-PCR验证筛选miRNAs的表达差异。分析候选miRNAs与50例ESCC患者临床病理特征之间的关系,验证其与淋巴结转移的相关性。分析受试者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线的曲线下面积（area under the curve,AUC）及p值评估miRNA预测ESCC淋巴结转移的效能。结果1.微阵列分析发现LNM组和NLNM组ESCC样本之间有62个显著差异的miRNAs（FC绝对值＞2且p＜0.05）;其中对比NLNM组,LNM组有19个miRNAs显著上调、43个miRNAs显著下调。2.从62个miRNAs中进一步筛选了 19个在50例ESCC组织中进行qRT-PCR验证,结果对比 NLNM 组,有 3 个 miRNAs（miR-19a-3p p=0.0142、miR-17-3p p=0.0015和miR-18b-5p p=0.0034）在LNM组中表达显著上调。3.3个miRNAs与50例ESCC患者的TNM期（p＜0.01）和淋巴结转移显著相关,与其他临床病理特征无相关性（p＞0.05）。4.ROC 曲线分析提示 miR-19a-3p（AUC=0.694、p=0.018）、miR-17-3p（AUC=0.730、p=0.005）和 miR-18b-5p（AUC=0.778、p=0.001）对 ESCC 淋巴结转移均有一定的预测效能。结论LNM组ESCC组织中miR-19a-3p、miR-17-3p和miR-18b-5p的表达明显升高,且与淋巴结转移显著相关,可能成为ESCC淋巴结转移的预测因子。第二部分 下调miR-19a-3p通过上调CDH11抑制ESCC细胞的侵袭和迁移背景与目的miRNAs可以在转录后水平调节基因表达,并在恶性肿瘤的发生和发展中发挥重要作用。其中miR-19a-3p既可作为癌基因也可作为抑癌基因调节肿瘤的多种生物学过程。目前还没有研究发现miR-19a-3p在食管鳞癌中的直接作用,但在其他肿瘤中的双向调控能力已被广泛报道。该部分研究首次通过体外实验来探索miR-19a-3p对ESCC细胞生物学功能的调节作用,并寻找可能的下游靶基因。方法以敲低（knockdown,KD）miRNA/阴性对照（negative control,NC）慢病毒载体成功转染ESCC细胞系KYSE-150和TE-1,Celigo划痕实验检测迁移能力,qRT-PCR和蛋白质免疫印记法（western blot,WB）检测目的基因的表达水平,CCK-8检测细胞增殖活性,Transwell实验检测细胞侵袭和迁移能力。生物信息学方法和qRT-PCR筛选miR-19a-3p的靶基因信使RNA（messenger RNA,mRNA）,双荧光素酶报告基因系统验证miR-19a-3p是否直接靶向钙黏蛋白11（cadherin 11,CDH11）的3’端非翻译区（3’untranslated region,3’UTR）。以CDH11 OE/NC慢病毒转染ESCC细胞系,然后检测CDH11的表达水平以及细胞的侵袭和迁移能力。最后以CDH11 siRNA/si-NC和miR-19a-3p KD/NC转染ESCC细胞系进行挽救实验。实验重复3次。结果1.慢病毒成功转染ESCC细胞后KD组（miR-19a-3p knockdown）KYSE-150（p＜0.001）和TE-1（p＜0.001）细胞的迁移率显著下降,miR-19a-3p作为目的miRNA进行后续实验。2.对比NC组,KD组ESCC细胞miR-19a-3p的表达水平显著降低（p＜0.001）,KYSE-150（p＜0.01）和TE-1（p＜0.001）细胞的侵袭和迁移数目明显减少,但增殖活性没有差别（p＞0.05）。3.KYSE-150 和 TE-1 细胞系 KD 组 CDH11 的转录（p＜0.001）和蛋白（p＜0.01）表达水平比NC组明显升高。4.双荧光素酶报告基因系统证实CDH11 3’UTR是miR-19a-3p的直接结合靶点,p＜0.01。5.过表达CDH11后KYSE-150和TE-1两种细胞系中CDH11的表达水平显著升高（p＜0.001）,KYSE-150（p＜0.01）和TE-1细胞（p＜0.001）的侵袭和迁移数目明显减少。6.miR-19a-3p KD+CDH11 siRNA组CDH11 的表达水平比KD组明显下降（p＜0.001）,平均侵袭和迁移细胞数目明显增加（p＜0.001）,与NC组无显著差异（p＞0.05）。结论抑制miR-19a-3p能降低ESCC细胞的侵袭和迁移能力,CDH11是miR-19a-3p的下游靶基因,过表达CDH11后也能抑制细胞的侵袭和迁移,而抑制CDH11可以逆转下调miR-19a-3p引起的ESCC细胞侵袭和迁移抑制的效应。该论文首次发现miR-19a-3p至少部分靶向CDH11调节ESCC细胞的侵袭和迁移,具体机制仍有待研究。