【摘 要】
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本研究构建了基因工程减毒LM,并利用减毒LM表达PEDV流行毒株保护性抗原,研制猪流行性腹泻口服疫苗,主要研究内容如下:(1)测定了流行毒株(PEDV/CHN/SHANGHAI 5/2012)的全基因
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本研究构建了基因工程减毒LM,并利用减毒LM表达PEDV流行毒株保护性抗原,研制猪流行性腹泻口服疫苗,主要研究内容如下:(1)测定了流行毒株(PEDV/CHN/SHANGHAI 5/2012)的全基因组序列,分析结果显示该毒株为强毒力的Non-S INDEL毒株,与经典毒株CV777遗传距离较远。(2)基于PEDV的N基因,建立了TaqMan探针RT-qPCR检测方法,标准曲线的相关系数R~2为0.996;20μL反应体系可检测约1.4×10~2个拷贝的标准质粒分子;基于N、S基因,建立了常规双重RT-PCR检测方法;定量和常规RT-PCR检测猪的几种常见病毒结果均为阴性,即特异性良好;可满足PEDV的定量和定性分析需求。(3)利用大肠杆菌分别表达PEDV S蛋白的COE(502-641aa)和S1D(639-792 aa),Western-blot结果显示镍柱纯化的COE和S1D蛋白均与流行毒株感染猪的阳性血清呈强阳性反应,为后续建立检测抗体的间接ELISA提供了包被抗原。(4)在ΔactA/plcB双缺失减毒株基础上,构建了ΔactA/plcB/inlB缺失减毒株,利用ΔactA/plcB/inlB减毒株分别融合表达COE-EGFP、S1D-EGFP,共聚焦观察显示目的蛋白已表达。动物试验正在进行。
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