我国香菇产量与出口量长期稳居世界首位,然而香菇重金属镉超标带来的食品安全问题,不仅对消费者健康构成潜在威胁,也严重影响了其出口贸易。研究发现香菇自身具有较强的镉富集特性,镉结合蛋白作为重要的“桥梁”或“纽带”在香菇镉富集的过程中发挥着重要的作用。因此,开展香菇镉结合蛋白的研究对解析香菇镉富集的分子机制,探寻有效的调控策略以降低香菇中镉含量具有重要意义。本文探究了环境因素对香菇菌丝生长及镉富集的影响;从香菇菌丝中分离纯化得到镉结合蛋白（LECBP）,对LECBP进行了分子水平鉴定与性质分析;克隆得到编码LECBP的基因,对LECBP的结构域、跨膜区、信号肽、糖基化位点、磷酸化位点、同源性及高级结构等进行了生物信息学分析;构建了LECBP的大肠杆菌外源表达系统,明确了LECBP在香菇镉积累中的重要作用,分析了镉离子与LECBP的结合作用机制。主要研究结果如下:1.环境因素对香菇菌丝生长、生物量积累及镉富集的影响采用一定浓度的镉、不同温度、不同p H及金属离子条件培养香菇菌丝,探究这些环境因素对香菇菌丝生长、生物量积累及镉富集的影响。结果表明:镉浓度对菌丝生长速度及生物量积累均呈“低促高抑”的作用;香菇菌丝具有很强的镉富集能力,菌丝镉含量随外源镉浓度增加而显著增加。25℃时菌丝生长速度及生物量积累均处于较高水平;15-30℃范围内,菌丝中镉含量随温度升高呈下降趋势。p H 5时菌丝生长速度及生物量积累均达到最大值;菌丝中镉含量随p H增加呈先升后降趋势,p H 4时达到最大值。金属离子与镉共同作用时,Zn2+显著促进菌丝生长及生物量积累,Ca2+、K+、Na+显著抑制菌丝生长,而Fe2+、Ca2+、K+使菌丝生物量显著降低;Mn2+能显著促进菌丝对镉的富集,而Mg2+、Ca2+、Fe2+、Zn2+具有显著的抑制作用。2.香菇镉结合蛋白的提取、分离纯化及性质分析采用超声波提取技术对香菇镉结合蛋白进行提取;通过硫酸铵分级沉淀结合Sephadex G-50凝胶过滤、DEAE-Sepharose FF离子交换层析及Tricine-SDS-PAGE蛋白电泳纯化香菇镉结合蛋白;通过微量热泳动、圆二色谱、内源荧光光谱等对镉结合蛋白的性质进行研究。超声波提取工艺为:料液比为1:15,提取时间为40 min,超声波提取功率96 W。采用40-70%饱和度硫酸铵富集香菇菌丝中的镉结合蛋白,经分子筛与离子交换色谱纯化得到两个潜在的镉结合蛋白peak A-1和peak B-1;通过比较电泳前后蛋白中镉含量、构建蛋白凝胶的镉分布图谱发现peak B-1蛋白（LECBP）呈现出较强的镉结合稳定性。LECBP具有较高的镉结合亲和性（Kd值为97.3μM）,二级结构中α-螺旋,β-折叠,β-转角及无规则卷曲含量分别为15.7%,39.4%,8.0%和37.1%;LECBP中的Trp残基多暴露在周围的极性环境中;高温或者酸性环境显著降低蛋白的镉结合能力,严重破坏其原有构象。3.LECBP的鉴定、编码基因的克隆及生物信息学分析采用Nano LC-ESI-MS/MS测定LECBP的氨基酸序列,LECBP理论分子量24569.39 Da,含有220个氨基酸,无Cys,为一种非金属硫蛋白。Lecbp基因全长为921 bp,编码区长度为726 bp,包含2个外显子和1个内含子;5’非编码区长度为4 bp,3’非编码区长度为191 bp。采用实时荧光定量PCR分析发现,低浓度的镉可以显著上调Lecbp基因的表达,而高浓度的镉显著下调该基因的表达。通过生物信息学分析发现,LECBP理论等电点9.21,消光系数36440,是一种亲水性的、稳定性较高的蛋白;无保守结构域、无跨膜区、不具有信号肽、最可能存在于细胞质中;无N-糖基化位点,存在5个可能的的O-糖基化位点及20个潜在的磷酸化位点。同源性分析结果表明,与LECBP同源性较高的13个蛋白均来自担子菌纲中的蘑菇,同源性为28.24-80.21%,而这些蛋白均为假定蛋白。PDB数据库搜索表明,LECBP可能为第一个在蘑菇中鉴定到的非金属硫蛋白的镉结合蛋白,且可能具有与已知蛋白不同的功能特性。采用I-TASSER构建了LECBP的三维模型,该模型折叠正确,且有正确的拓扑结构。4.重组LECBP的性质及生物学功能分析构建了pET28a-Lecbp表达载体及大肠杆菌工程菌,通过蛋白凝胶电泳结合Western blot验证,确定了重组LECBP成功表达。IPTG诱导处理后,工程菌对镉的积累能力显著增强,为对照组的5.2-21.0倍;且随着培养时间的延长,菌体对镉的积累能力显著增加。采用透射电镜扫描结合细胞质中镉含量测定发现,诱导处理后工程菌细胞质中镉含量显著增加。采用镍亲和层析柱分别对有无镉添加条件下工程菌中诱导表达的重组LECBP进行纯化,纯化的重组蛋白均呈单一的条带,且分子量与LECBP理论分子量一致;镉添加条件下纯化得到的重组蛋白具有较高的镉吸收。高效液相色谱分析表明,重组LECBP纯度高达95%。圆二色谱与内源荧光光谱分析表明,LECBP与镉结合后形成新的Cd-LECBP复合物,改变了原来的蛋白构象:与LECBP相比,Cd-LECBP二级结构中的α-螺旋、β-转角及无规则卷曲含量分别由37.1%、18.6%、24.2%增加为38.3%、21.3%及24.6%,β-折叠含量由20.2%降低到15.8%;且Cd-LECBP在λmax处的荧光强度显著增强。采用红外光谱分析发现,LECBP氨基酸残基中的羧基氧原子及氨基氮原子可能参与了Cd-LECBP复合物的形成;通过定点突变研究发现,Glu和His氨基酸残基可能作为关键的结合位点,参与了镉的结合,且LECBP中可能还存在其他与镉结合有关的氨基酸位点。