目的:在本实验室建立产生感染性HCV的细胞模型,监测HCV滴度随时间变化的曲线,从而大量制备高滴度的感染性病毒用于HCV的各项研究。我们用制备的HCV感染正常肝细胞和肝癌细胞,比较感染前后对TRAIL诱导的凋亡的敏感性变化,初步探索其凋亡变化机制,以期发现新的靶基因或方法,为丙型肝炎和丙型肝炎所致肝癌的治疗提供一定的理论基础。　　方法:1.将FL-JFH1质粒扩增、酶切鉴定后,体外逆转录FL-JFH1并纯化,然后电转至Huh7.5.1,常规传代培养转染后的Huh7.5.1,收集14天左右的细胞培养上清。利用此JFH1上清按照MOI=0.1和MOI=1感染Huh7.5.1,特定时间点收集细胞培养上清。利用HCV荧光定量PCR测定HCV滴度,绘制HCV滴度随时间变化的曲线,以便大量制备JFH1上清。　　2.用MTT法,先确定正常肝细胞LO2和肝癌细胞Huh7.5对病毒及TRAIL处理的最佳时间及剂量后,再检测正常肝细胞LO2和肝癌细胞Huh7.5分别用50ng/mlTRAIL处理、HCV感染及用HCV感染加50ng/mlTRAIL处理后,与对照细胞相比,各实验组细胞死亡或凋亡情况。　　3.用RT-PCR以及Western blot,检测正常肝细胞LO2和肝癌细胞Huh7.5分别用50ng/mlTRAIL处理、HCV感染及用HCV感染加50ng/mlTRAIL处理后,与对照细胞相比,其与TRAIL凋亡信号途径相关的分子如DR4,DR5,c-FLIP(L)在mRNA以及蛋白质水平的变化情况。　　结果:1.JFH1按照MOI=0.1和MOI=1分别感染Huh7.5.1后,两者JFH1滴度在感染第8天MOI=1略高于MOI=0.1,第12天基本持平并达到最高值,两周后变化基本相同。2.MTT结果显示,LO2对TRAIL不敏感,感染HCV后对TRAIL变得敏感;Huh7.5对TRAIL敏感,感染HCV后变得对TRAIL更加敏感。　　3.在LO2细胞中,DR4、DR5 mRNA在各组中无明显变化,c-FLIP(L) mRNA在JFH1+TRAIL组中降低,但c-FLIP(L)蛋白水平却有所上升;在Huh7.5细胞中,DR4 mRNA在JFH1+TRAIL组中下降,DR5 mRNA在各组中无明显变化,c-FLIP(L)在TRAIL组、JFH1组、JFH1+TRAIL组中降低。蛋白检测发现DR5在JFH1+TRAIL组中略有上升,而c-FLIP(L)则显著下降。　　结论:正常细胞LO2感染HCV后对TRAIL敏感的机制不是通过DR4、DR5和c-FLIP(L)。肝癌细胞Huh7.5感染HCV后变得对TRAIL非常敏感,其机制可能同DR5蛋白水平表达增高与c-FLIP(L)蛋白水平下降相关。