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鸭病毒性肠炎(Duck viral enteritis,DVE),又名鸭瘟(Duck plague,DP),是由鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)引起的鸭、鹅及多种雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病,给养鸭业造成了巨大的经济损失。DEV属疱疹病毒科未分类病毒,具有疱疹病毒典型的形态和结构。糖蛋白E(gE)是疱疹病毒的主要囊膜蛋白之一,由us8基因编码。疱疹病毒gE是病毒复制非必须的,对病毒毒力和在细胞与细胞间的直接传播起重要作用,能刺激机体产生体液免疫和介导细胞免疫应答,是重组疫苗、亚单位疫苗和疱疹病毒血清学诊断方法的候选抗原。因此,对gE的研究不仅对了解病毒分子生物学功能特征有重要意义,对临床诊断、疾病预防、基因工程疫苗研究也很重要。目前还未见到有关DEV gE基因及其编码产物的深入研究。本试验以DEV gE基因为研究对象,采用PCR技术克隆了DEV C-KCE株gE基因,并对该基因与其他疱疹病毒的同源性、编码蛋白的结构及抗原性等做了较为详尽的生物信息学分析。在此基础上利用大肠杆菌表达系统pET30a(+)(E. coli Rosetta),分别表达了gE成熟蛋白(pET-gE)、gE成熟蛋白胞外区(pET-gEBW)及gE成熟蛋白胞内区(pET-gEBN),经SDS-PAGE分析表明融合蛋白大小分别为60 KDa、50 KDa及20 KDa,Western blot分析表达产物均可与DEV阳性血清发生特异性免疫反应。选择表达量高、抗原性好的pET-gEBW蛋白,切胶纯化后免疫家兔制备了兔抗DEV-gE的多克隆抗体,经Western blot和IFA鉴定,表明制备的多抗血清反应性良好,能与全病毒反应并可识别病毒上的gE天然糖蛋白。通过间接免疫荧光试验确定gE的亚细胞定位,发现荧光主要集中于细胞膜和细胞质中。兔抗DEV-gE血清噬斑减数中和试验结果显示,制备的血清具有中和活性,证明糖蛋白gE上含有中和抗原表位。为进一步探究gE蛋白的功能,通过病毒与兔抗DEV-gE抗体作用的方法,研究了gE蛋白对DEV的吸附、侵入、细胞到细胞间直接传播(CTCS)的作用。结果表明,添加兔抗DEV-gE抗体后试验组相比对照组吸附率降低了18.19%,差异显著(p<0.05),说明gE蛋白对病毒的吸附过程有一定作用;但添加兔抗DEV-gE抗体后试验组与对照组侵入率分别为53.24%和51.39%,差异不显著,说明gE蛋白可能不参与病毒的侵入过程;此外,添加兔抗DEV-gE抗体能够降低病毒在细胞培养物上的滴度,并促使DEV在CEF单层细胞上形成的噬斑变小,实验组和对照组差异显著(p<0.05),证明糖蛋白gE参与了病毒在细胞与细胞间直接传播的过程。此外,本实验利用PCR方法扩增DEV C-KCE株gE基因同源臂片段(包含gI基因及其侧翼序列),扩增产物克隆入pGEM-T载体测序后亚克隆至pUC19 EcoRⅠ、SaIⅠ位点间,获得pUC-gE。将增强型绿色荧光蛋白表达盒插入pUC-gE BamHⅠ位点,构建转移载体pUC-gE-EGFP。将pUC-gE-EGFP转染鸭胚成纤维细胞(DEF),可观察到绿色荧光,说明EGFP基因获得有效表达,为今后构建重组鸭肠炎病毒,开发以鸭肠炎病毒为载体的多价、多联基因工程疫苗提供了物质基础。