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近年来,肿瘤细胞化疗药物耐药是引起治疗失败的重要原因,研究肿瘤细胞耐药性的产生机制和探索逆转耐药的途径是目前肿瘤治疗研究的热点领域。肿瘤对化疗药物的耐药性可分为原发性耐药和获得性耐药,临床上后者多见。产生多药耐药的机制非常复杂,一般认为基因遗传学水平的变异与肿瘤原发性耐药密切相关,而基因表观遗传学水平失调往往与获得性耐药有着特征性联系。在肿瘤获得性耐药发生过程中,相关耐药基因的表达调控主要通过DNA位点甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA来进行。microRNA(miRNA)以转录后调控的方式广泛参与了生物进化与发育,细胞分化与恶变,细胞增殖与凋亡等各种生命活动过程。近年来的研究表明,miRNA除了可以作为生物学标记物对肿瘤诊断和预后作出评价,更重要的是肿瘤耐药性与miRNA异常表达有着特征性的联系。抑制和重新表达耐药相关miRNA可以提高抗肿瘤药物的疗效,目前肝癌耐药相关miRNAs的报道较少,已有研究发现：在肝癌细胞中miR-221和miR-222过度表达,分别下调上述miRNAs可恢复PTEN和TIMP3的表达,进而抑制AKT通路,提高肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)的敏感性,增强化疗药物的作用,并降低肿瘤细胞的侵袭性。为进一步分析肝癌顺铂耐药相关miRNAs的作用与分子机制,本实验进行了如下研究：目的方法：1.利用高通量miRNA芯片联合实时荧光定量RT-PCR比较肝癌耐药细胞HepG2/CDDP和其亲本细胞HepG2 miRNA表达谱差异；采用靶基因预测软件筛选出能与Nrf2-3’-UTR区相互作用的miRNAs;通过以上两种方法结果的比对,最终确定miR-340为我们所要研究的目的miRNA。2.运用瞬时转染miR-340模拟物和抑制物的方法分别上调和下调顺铂耐药和亲本肝癌HepG2细胞系中miR-340的表达,并设阴性对照、空白对照和联合转染(miR-340模拟物+miR-340抑制物)组,并用通过实时荧光定量RT-PCR法对转染效率予以验证。通过CCK8法检测细胞增殖、药物半数致死剂量(IC50)、流式细胞术检测细胞凋亡等实验分析miR-340对肝癌细胞耐药表型的影响。3.运用双荧光素酶报告基因技术验证miR-340与Nrf2的靶向关系,并通过实时荧光定量RT-PCR和Westernblot等技术检测上述各组转染成功细胞株内Nrf2及下游基因表达水平的变化,从而揭示miR-340调控肝癌HepG2细胞顺铂耐药的分子机制。结果：1.高通量miRNA芯片比较发现：HepG2/CDDP和其亲本细胞HepG2相比有17条显著差异表达的miRNAs,其中9条显著上调(>=2.0 fold),8条显著下调(<0.5 fold),实时荧光定量PCR结果显示：相对于亲本细胞HepG2,miR-340在顺铂耐药细胞系中的表达水平明显下调,且其下调幅度(change fold=0.07,P<0.01)在所有下调表达的miRNAs中最为显著。2.转染miR-340模拟物可显著上调顺铂耐药肝癌HepG2细胞中miR-340表达水平,并显著增加顺铂对HepG2/CDDP细胞诱导的凋亡率,进而降低耐药细胞对化疗药物的IC50；相反,转染miR-340抑制物可显著下调亲本肝癌细胞珠中miR-340表达水平,并显著降低顺铂对HepG2细胞诱导的凋亡率,进而提高亲本细胞对化疗药物的IC503.双荧光素酶实验证实Nrf2基因的3’-UTR携带有miR-340的直接结合位点,并且上调miR-340表达能显著抑制耐药肝癌细胞HepG2/CDDP中Nrf2及其下游基因的表达；相反在亲本细胞株中下调miR-340表达可促进亲本HepG2细胞中Nrf2及其下游基因的表达。结论：通过高通量miRNA芯片比较,我们首次发现了一组肝癌顺铂耐药相关miRNAs分子,而miR-340可能是这组分子中影响肝癌顺铂耐药性状的关键miRNAs分子；miR-340在肝癌顺铂耐药细胞中表达水平显著低于相应亲本细胞,上调miR-340表达可以通过拮抗Nrf2抗氧化应激通路进而部分逆转肝癌耐药细胞株对顺铂的耐药。