重组枯草芽孢杆菌生产核黄素是目前最先进的核黄素工业生产技术。构建高产核黄素的重组菌，关键问题之一是提高核黄素操纵子的表达水平。利用游离或整合的表达质粒过量表达核黄素操纵子，需要利用抗生素的选择压力维持游离质粒的稳定，或者维持整合质粒在染色体上的多拷贝状态。在重组枯草芽孢杆菌中，重组质粒不稳定问题是限制重组枯草芽孢杆菌工业应用的主要因素。实现单拷贝基因在染色体上的高水平表达，构建无抗性基因标记的重组菌株，是解决重组质粒不稳定，避免抗性基因和抗生素危害的有效手段。 本文利用B.subtilis gInR基因天然的组成型强表达启动子和含有SD序列的mRNA前导区编码序列，对B.subtilis核黄素操纵子的启动子区域进行原位替换修饰，目的是去除原有的riboswicth调控元件，更换强启动子，在mRNA的5’末端引入另一个SD序列，以实现核黄素操纵子的高水平表达。 通过重叠PCR拼接了一段带有氯霉素抗性基因和核黄素操纵子上下游序列的A-CAT-R片段，转化过量合成核黄素的B.subtilis24X1，通过双交换重组，用氯霉素抗性基因将核黄素操纵子的启动子区域交换下来，得到了抗氯霉素的核黄素缺陷型B.subtilis24 CS1。 通过重叠PCR拼接了一段包括gInR基因启动子区域和核黄素操纵子上下游序列的A-prm-R片段，转化B.subtilis24 CS1，通过同源重组将氯霉素抗性基因交换下来，同时修饰了核黄素操纵子的启动子区域，得到了转化子B.subtilis24CS2。菌落呈现的黄色表明，修饰后的启动子区域能够使核黄素操纵子正确表达。