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恶性黑色素瘤(malignant melanoma, MM)简称恶黑,是一种恶性程度极高的皮肤肿瘤,多发生于皮肤体表,占皮肤恶性肿瘤的7%-20%,可转移至肺和脑等部位。近年来恶黑发病率,死亡率呈不断上升趋势,发病年龄也愈来愈早,且极易扩散,复发率高,受到人们重视。目前,针对恶黑的治疗手段包括手术、放疗、化疗、免疫治疗等,但是由于部分黑色素瘤细胞对放疗、化疗的抵抗,造成黑色素瘤的复发,成为彻底清除肿瘤的最大障碍。因此寻找新的治疗途径已成为提高恶黑患者生存率的关键。以免疫治疗为主的生物治疗已经发展成为肿瘤治疗的新模式。免疫治疗一般包括：细胞因子治疗、过继性免疫治疗、肿瘤疫苗、抗体为基础的免疫治疗、分子靶向治疗等。其中肿瘤的治疗性疫苗,尤其是肿瘤细胞疫苗、基因工程疫苗等都取得了可喜的进展。疫苗能够激活机体的自然杀伤细胞(NK)和特异性细胞毒性T细胞(CTL),产生抗肿瘤的保护性免疫应答作用,有着广阔的应用前景。但由于肿瘤抗原免疫原性弱、肿瘤免疫逃逸机制复杂、肿瘤的异质性等原因,疫苗的实际疗效与预期有很大差距,如何提高肿瘤疫苗免疫原性,激发宿主免疫系统对瘤细胞免疫攻击效应已成为研究内容之一。以整个肿瘤细胞作为抗原来源是肿瘤疫苗发展趋势之一,具有不需鉴定其肿瘤特异性抗原的优点,但其免疫原性弱、特异性差,因此需要人为的改变其免疫原性或以细胞因子为佐剂,改变接种部位微环境,激活抗原提呈细胞(APC),增强免疫反应。本课题组前期的部分实验结果提示：向小鼠黑色素瘤B16F10细胞导入糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidyl inositol, GPI)修饰的6kD结核杆菌早期分泌靶抗原(6kD early secretary antigenic target, ESAT-6)和白细胞介素-21(IL-21)基因制成的瘤苗,膜表达强免疫原性的“异种抗原”ESAT-6,打破机体的免疫耐受,诱导产生肿瘤特异性的免疫应答,而分泌表达的IL-21作为免疫佐剂可增强荷瘤鼠NK、CTL抗肿瘤活性,两者分别以不同机制发挥诱导抗肿瘤免疫应答,但这种效应对肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)作用如何仍有待研究。CSCs是肿瘤中具有干细胞特性的一类细胞,既具备高度增殖能力与自我更新能力,也具备多向分化潜能的细胞,这部分细胞虽只占少部分,但却是肿瘤发生、发展的关键细胞,对恶性肿瘤的治愈有着深远的意义。CSCs做为抗肿瘤研究的靶细胞,近几年来对其研究在不断深入,如用CSCs联合树哭状细胞(DC)免疫小鼠后,能拮抗野生型肿瘤细胞的攻击,表现出明显的抗肿瘤效果。本研究选择小鼠黑色素瘤细胞系B16F10细胞,将构建好的pIRES-ESAT-6-gpi/IL-21通过脂质体转染B16F10细胞并筛选稳定转染株。然后从中分选出B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21 CD133+CD44+CSCs免疫C57BL6小鼠,研究其免疫效应与拮抗肿瘤效应。目的：探讨表达ESAT-6-gpi和IL-21的黑色素瘤B16F10 CD133+CD44+CSCs瘤苗抗肿瘤效应,为以CSCs瘤苗治疗黑色素瘤提供实验依据。方法：1.将构建好的重组质粒pIRES-ESAT-6-gpi/IL-21通过脂质体转染B16F10细胞,并通过G418筛选稳定转染的细胞株。用免疫荧光和Western blot分别检测稳定转染细胞株ESAT-6和gpi/IL-21在细胞膜表面的表达。2.将单克隆扩大培养的B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21细胞,利用免疫磁珠分选技术分离出B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21CD133+CD44+CSCs,以5×105个经丝裂霉素灭活的细胞免疫C57BL/6小鼠,共免疫三次,每次间隔14天,末次免疫后10天,以5×105 B16F10野生型细胞攻击免疫鼠。同时设B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21 CD133-CD44-细胞、B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21细胞和B16F10 CD133+CD44+CSCs为对照,以上述同样方法免疫和攻击小鼠。3.观察各组小鼠肿瘤生长情况,并通过检测免疫小鼠血清细胞因子,补体依赖的细胞毒活性(CDC)、脾细胞、NK细胞毒活性以及上皮间质转化(EMT)相关蛋白表达,比较CSCs瘤苗与普通瘤苗的抗肿瘤效果差异。结果：1.经免疫荧光和Western Blot检测,证实稳定转染的B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21膜表达异种抗原ESAT-6,并且分泌表达IL-21,且瘤苗免疫小鼠血清中检测到ESAT-6抗体。2.用免疫磁珠分选技术分选出B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21 CD133+CD44+CSCs细胞,免疫C57BL6小鼠后,B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21 CD133+CD44+CSCs瘤苗免疫小鼠成瘤率,肿瘤体积,肿瘤生长速度均较普通瘤苗低,差异均有显著性意义,(P<0.05或P<0.01)。3. B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21 CD133+CD44+CSCs瘤苗免疫组小鼠血清IFN-γ水平,CDC、脾细胞及NK细胞毒活性均较普通瘤苗高,差异有明显的统计学意义(P<0.01)。CSCs瘤苗免疫组小鼠肿瘤组织中EMT相关蛋白即E-钙黏着蛋白高表达,波形蛋白低表达,差异有显著性意义,(P<0.05)。结论：本研究制备出基因修饰的B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21 CD133+CD44+CSCs瘤苗,能有效的诱导特异性细胞免疫以及体液免疫反应,显示出有效的抗肿瘤效应,为以CD133+ CD44+CSCs瘤苗治疗黑色素瘤提供可供参考的实验依据。