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背景食管癌是全世界癌症死亡的第六大原因。在中国,食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)的发病率在全球最高。目前ESCC的五年生存率低,主要是因为ESCC患者早期多无特异临床症状。食管内镜及病理活检等诊断方法存在局限性且对早期ESCC的诊断率仍然较低。传统肿瘤相关抗原类(Tumor-associated antigens,TAAs)血清学指标均不同程度的存在低敏感性或低特异性等问题。与ESCC相关的自身抗体是近几年研究的热点。研究发现,从ESCC发展到临床症状出现之前的3-5年间,就可在血清中检测出肿瘤相关自身抗体。因此,肿瘤相关自身抗体的检测有望为ESCC早期诊断带来新的突破点。目的本项目组前期采用高通量蛋白芯片(HuProt v3.0,含20240种蛋白,美国约翰霍普金斯医学院高通量生物学中心提供)技术,经一系列筛选、验证步骤,共发现8种IgG型血清自身抗体标志物抗TP53、ETHE1、CTAG1A、C1QTNF1、TEX264、CLDN2、NSG1、HRAS抗体对早期肺癌(Lung cancer,LC)具有较好的诊断价值。有趣的是,在一项小样本队列研究中,本项目组发现8种已知的自身抗体中抗TP53、HRAS、CTAG1A及NSG1在早期ESCC组和晚期ESCC组中的阳性率及水平均明显高于食管良性病变(Esophageal benign lesions,EBL)组或健康对照(Health control,HC)组(P<0.01)。鉴于自身抗体在肿瘤早期诊断的明显优势,是否上述4种自身抗体联合抗原类肿瘤标志物对ESCC具有较好的早期诊断价值值得探讨。方法1.构建酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法,检测小样本队列8种IgG型自身抗体标志物抗TP53、ETHE1、CTAG1A、C1QTNF1、TEX264、CLDN2、NSG1、HRAS抗体对ESCC早期诊断的价值。小样本队列包括50例早期ESCC患者、50例晚期ESCC患者、50例EBL患者与50例HC。2.采用免疫印迹法(western blotting)法验证早期ESCC血清抗TP53、HRAS、CTAG1A及NSG1抗体的ELISA检测结果。3.构建ELISA法检测及验证569例大样本血清中抗TP53、HRAS、CTAG1A及NSG1抗体对ESCC早期诊断的价值,开展的研究队列包括409例的训练集与160例具独立匹配性的验证集。训练集由129例早期(0/Ⅰ/Ⅱ)ESCC患者,130例EBL患者和150例HC组成,验证集由50例早期(0/Ⅰ/Ⅱ)ESCC患者,50例EBL患者和60例HC组成。4.采用构建的Luminex xMAP多重检测方法检测160例具独立匹配性验证集样本中抗TP53、HRAS、CTAG1A及NSG1抗体。5.采用免疫组织化学技术检测TP53、HRAS、CTAG1A及NSG1蛋白在早期ESCC癌组织和配对癌旁组织中的表达情况。6.采用化学发光法检测训练集血清4种ESCC抗原类肿瘤标志物CEA、CYFRA21-1、CA19-9及SCCAg的水平。分析4种抗原类肿瘤标志物单独检测对ESCC早期诊断的价值。7.比较训练集4种自身抗体组合模式与4种抗原类肿瘤标志物组合模式对ESCC早期诊断性能上的差异;分析并建立4种自身抗体组合与抗原类肿瘤标志物的联合检测模式,以进一步提高对ESCC早期诊断的性能。结果1.小样本队列ELISA检测结果显示,8种血清自身抗体中,抗TP53、HRAS、CTAG1A及NSG1在早期ESCC组和晚期ESCC组的阳性率与水平均明显高于EBL组或HC组(P<0.01)。8种血清自身抗体中,抗ETHE1、C1QTNF1、TEX264及CLDN2的阳性率与水平在早期ESCC组、晚期ESCC组、EBL组或HC组间的差异无统计学意义(P>0.05)。2.抗TP53、HRAS、CTAG1A及NSG1抗体的western blotting检测结果与ELISA的检测结果相一致。3.在训练集中,抗TP53、HRAS、CTAG1A及NSG1抗体在早期ESCC中显示出比对照组更高的阳性率与水平(P<0.01),该队列4种自身抗体组合检测对ESCC早期患者诊断的AUC、敏感性和特异性分别为0.823、62.8%和88.9%。在验证集中,4种自身抗体在早期ESCC中显示出比对照组更高的阳性率与水平(P<0.01),该队列4种自身抗体组合检测对ESCC早期患者诊断的敏感性和特异性分别为58.0%和90.0%。4.发现验证集4种自身抗体的测定结果在ELISA和Luminex两种方法之间具有很好的相关性。采用Luminex xMAP多重检测方法检测验证集血清样本4种自身抗体组合的敏感性和特异性分别为66.0%和90.9%。同时,通过ELISA和Luminex两种方法检测验证集4种自身抗体,其组合检测阳性结果的吻合度高达73.0%。5.应用免疫组织化学技术检测TP53、HRAS、CTAG1A及NSG1蛋白的表达情况,发现ELISA测定结果为阳性(+)的早期ESCC患者的癌组织中4种蛋白的强阳性表达率均明显高于配对癌旁组织(P<0.01);ELISA测定结果为阴性(-)的早期ESCC患者的癌组织和配对癌旁组织中4种蛋白均呈现出较高的弱阳性表达率。6.在训练集中,早期ESCC组CEA(P<0.05)与CYFRA21-1、CA19-9、SCCAg(P<0.01)的阳性率及水平均高于EBL组或HC组;EBL组与HC组之间4种抗原类肿瘤标志物的阳性率及水平相比较无显著性差异(P>0.05)。单个指标对ESCC早期患者诊断的敏感性均不高,早期诊断的价值有限(AUC均≤0.646)。7.在训练集中,4种自身抗体组合模式与4种抗原类肿瘤标志物组合模式对早期ESCC诊断的特异性分别为88.9%、90.4%。4种自身抗体组合检测对早期ESCC患者诊断的AUC和敏感性分别为0.823和62.8%,明显高于4种抗原类肿瘤标志物组合检测的AUC(0.687)和敏感性(39.5%)(P<0.01)。4种自身抗体组合检测的敏感性在EBL组和HC组间相比较无显著性差异(P>0.05);4种抗原类肿瘤标志物组合检测的敏感性在EBL组和HC组间相比较无显著性差异(P>0.05)。8.在训练集中,4种自身抗体组合与CYFRA21-1、CA19-9、SCCAg组合的联合检测对ESCC早期患者的诊断性能最高,可将AUC提高至0.842。结论1.抗TP53、HRAS、CTAG1A及NSG1抗体对ESCC具有较好的早期诊断性能,其中以抗CTAG1A抗体对ESCC的早期诊断性能最高。4种自身抗体的组合检测有助于提高ESCC的早期诊断性能。2.CEA、CYFRA21-1、CA19-9及SCCAg对ESCC的早期诊断有一定价值,其中以CYFRA21-1对ESCC早期患者诊断的阳性率最高;以SCCAg对ESCC早期患者的AUC最高。然而,单个指标对ESCC早期患者诊断的阳性率均不高,早期诊断的价值有限。4种抗原类肿瘤标志物组合检测可在保证特异性的前提下提高对ESCC早期患者诊断性能。3.4种自身抗体组合检测对ESCC早期患者的诊断性能明显高于4种抗原类肿瘤标志物组合;建立4种自身抗体组合模式与CYFRA21-1、CA19-9、SCCAg组合的联合检测模式可显著提高对ESCC早期患者的诊断性能。