目的:探讨毒蕈碱型乙酰胆碱受体（mAChR）激动剂毛果芸香碱（pilocarpine）对脊髓腹角神经元甘氨酸受体（glycine receptor,GlyR）的作用及机制,以加深我们对脊髓运动控制机制的认识。方法:选取7-12天新生SD（Sprague Dawley）大鼠（雌雄不拘）,冰浴结合乙醚麻醉后,剥离出含腰骶膨大的脊髓节段,使用震荡切片机切取4-5片厚度为400-500μm的脊髓切片。经木瓜蛋白酶（Papin,0.18 g/30 ml人工脑脊液）在33℃恒温水浴锅中消化19-25 min后,在通入混合氧气（95%O2+5%CO2）的室温脑脊液中孵育40 min。显微镜下选取脊髓腹角,使用不同口径的巴斯德吸管进行机械分离,静置10-20 min待细胞贴壁。选取状态良好的神经元置于倒置显微镜下进行膜片钳记录。结果:1.脊髓腹角神经元形态的观察。40倍镜下观察到分离的脊髓腹角神经元状态良好,形态完整且立体感强,胞体大而具有多样性,突起较多且有分支。2.脊髓腹角神经元自发放电。其放电频率连续而稳定,基本上均有超射,提示细胞状态良好。3.Pilocarpine对脊髓腹角神经元甘氨酸电流的作用。我们的结果表明pilocarpine以浓度依赖性增强脊髓腹角神经元的甘氨酸电流。在实验记录的64例脊髓腹角神经元中,给予10μM pilocarpine预处理2 min后,其中有57例细胞记录到甘氨酸电流显著增大,并稳定至对照电流的152.42±28.65%（P＜0.01）。在剩余的7例细胞中,有5例细胞甘氨酸电流无显著变化,另外两例细胞甘氨酸电流较对照电流减小。4.M3-ACh R参与pilocarpine增大甘氨酸电流的作用。在记录的7例细胞中,给予10μM pilocarpine预处理2 min后,甘氨酸电流增大至对照电流的150.14±5.37%（P＜0.01）,而后应用M3-ACh R选择性拮抗剂4-DAMP预处理2 min后,可以完全取消pilocarpine增大甘氨酸电流的效应,为对照电流的100.20±4.76%（P＞0.05）。此外,在另5例细胞给予另一种M3-ACh R选择性拮抗剂J104129,也得到了相似的结果。给予10μM pilocarpine预处理2 min后,甘氨酸电流增大至对照电流的148.53±7.69%（P＜0.01）,而后使用J104129预处理2 min后,可完全取消pilocarpine对甘氨酸电流的增大效应,为对照电流的98.31±6.33%（P＞0.05）。5.Ca2+参与pilocarpine增大甘氨酸电流的作用。在无Ca2+细胞外液中,pilocarpine能将甘氨酸电流增大至对照电流的148.77±4.36%（P＜0.01,n=5）。随后,将BAPTA（10 m M）添加到电极内液中以螯合细胞内Ca2+,待电流稳定后,再应用pilocarpine预处理2 min,甘氨酸电流幅度为对照的98.25±4.70%（P＞0.05,n=7）。胞内给予Ryanodine受体拮抗剂Ryanodine后,pilocarpine预处理2 min后仍显著增大甘氨酸电流至对照的149.45±5.15%（P＜0.01,n=6）。然而,细胞内应用IP3受体拮抗剂肝素（5 mg/ml）,pilocarpine效应未能出现,电流幅度为对照的100.57±1.56%（P＞0.05,n=8）。此外,细胞内应用另一种IP3受体拮抗剂Xe-C也得到类似结果,毛果芸香碱预处理2 min后,电流幅度仍为对照的98.74±1.50%（P＞0.05,n=5）。6.PKC,但不是PKA,参与pilocarpine对甘氨酸电流的影响。使用PKC抑制剂Bis-IV（10μM）胞内给药,可完全取消pilocarpine对甘氨酸电流的增大作用,为对照的100.82±4.74%（P＞0.05,n=9）。此外,我们还使用了PKC的激动剂PMA。通过PMA预处理2 min,甘氨酸电流增大至对照电流的149.00±4.50%（P＜0.01,n=5）。然而,pilocarpine在PMA存在下不能进一步增强甘氨酸电流。在细胞内应用PKA抑制剂Rp-c AMP（50μM）后,pilocarpine仍使得甘氨酸电流显著增大至对照电流的151.03±15.91%（P＜0.01,n=5）。结论:本实验采用急性机械分离（联合酶消化）方法,分离出的脊髓腹角神经元状态良好,形态完整且立体感强,适用于膜片钳实验。Pilocarpine对脊髓腹角神经元甘氨酸电流的增强作用可能是经由M3-ACh R介导且激活胞内IP3/Ca2+/PKC信号通路实现的。