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红花,辛散温通,散瘀而消癥止痛、活血而通畅经脉,活血力强、善治瘀血诸证。红花最主要的有效活性化学成分是黄酮类化合物,红花黄酮生物合成途径,是非常重要的次生代谢途径之一,苯丙烷类合成代谢以苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase,PAL）催化的反应为起始反应。PAL基因是红花黄酮合成途径中的关键酶基因,目前,关于植物苯PAL基因的克隆及相关研究较多,但是,利用红花悬浮细胞同源表达PAL基因的研究还未见报道。本研究通过对红花PAL基因家族进行全基因组生物信息学分析,获得候选PAL基因序列,克隆一条红花苯丙氨酸解氨酶Ct PAL4基因。同时,优化了红花悬浮细胞遗传转化体系,利用农杆菌介导的方法,初步实现Ct PAL4基因在红花悬浮细胞中的过表达,为研究Ct PAL4基因在红花黄酮合成代谢途径中的功能奠定基础,为利用基因工程手段提高红花黄酮类化合物含量及黄酮化合物次生代谢合成的研究提供理论依据。主要实验结果如下:1.完成了红花PAL基因家族的生物信息学分析。通过对红花PAL基因家族进行生物信息学分析,共检索到6个红花PAL家族基因。红花中的Ct PAL1～5基因家族成员均含有MIO结构域,均可以催化苯丙氨酸生成肉桂酸。6个红花PAL家族基因上游启动子顺式作用元件数目和种类各不相同,并单独聚在一个进化枝,同时与拟南芥聚为一类,说明红花与拟南芥PAL基因家族的亲缘关系较近。转录组分析结果表明,红花PAL基因家族在不同花期、种子不同萌发阶段及不同组织器官表达量差异较大。成功克隆一条红花PAL基因（Ct PAL4）。根据候选PAL基因序列设计特异性引物,以红花花瓣c DNA为模板,通过RT-PCR获得Ct PAL4基因。经过梯度PCR实验,获得最佳退火温度为58℃,Ct PAL4完整编码框为2124 bp。2.完成了Ct PAL4基因的生物信息学分析。结果表明:Ct PAL4基因ORF为2124 bp,编码708个氨基酸,分子量为76.82 k Da。Ct PAL4基因编码的蛋白三维结构与苯丙氨酸解氨酶X射线蛋白质晶体结构类似,为同源四聚体结构,且与PAL具有相同的结构域,且具有PAL的典型特征。亚细胞定位预测其在细胞中的位置可能定位在叶绿体和细胞质。系统发育进化树结果显示,红花PAL基因与拟南芥PAL聚为一类,亲缘关系较近。3.成功构建了Ct PAL4基因植物表达载体。以p CAMBIA 3301作为植物表达载体骨架,将测序正确的Ct PAL4两端分别引入酶切位点Bgl II和Bst E II,通过双酶切-连接方式将Ct PAL4替换掉载体上的GUS报告基因,构建p CAMBIA3301-Ct PAL4植物表达载体,利用冻融法将p CAMBIA 3301-Ct PAL4转入EHA105农杆菌感受态细胞中。4.优化了红花悬浮细胞遗传转化体系,并初步实现了Ct PAL4基因在悬浮细胞内的过表达。对红花种子暗培养而成的无菌苗子叶外植体进行愈伤诱导、增殖、羧苄（75 mg/L）-头孢（100 mg/L）-草甘膦（1 mg/L）筛选,继代培养获得的红花愈伤组织用作遗传转化受体;农杆菌介导的红花Ct PAL4基因遗传转化条件:重悬液OD600=0.5、工程农杆菌OD600=0.8、在真空度10 mba条件下侵染15 min,共培养4天获得转基因红花愈伤组织;上述转基因红花愈伤组织经过轻微机械振动,形成均一的转Ct PAL4基因红花悬浮细胞。β-葡聚糖苷酶GUS组织化学分析,转基因红花愈伤组织70%以上染色为蓝色细胞,说明遗传转化体系建立成功。对转Ct PAL4基因红花悬浮细胞进行PCR检测,目的基因条带位置与理论位置一致,说明Ct PAL4基因整合到红花悬浮细胞基因组中。综上所述:完成了红花PAL基因家族的生物信息学分析,成功克隆一条Ct PAL4基因,构建了p CAMBIA 3301-Ct PAL4植物表达载体,优化了转Ct PAL4基因的红花悬浮细胞体系,并实现了Ct PAL4基因在红花悬浮细胞内的同源表达。红花悬浮细胞的Ct PAL4的成功导入与表达,为研究Ct PAL4等合成代谢关键酶基因在次生代谢产物中的功能及红花黄酮类化合物次生代谢合成调控提供理论依据。