研究目的:　　通过RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RIP）联合高通量测序技术（RIP-Seq）在人肝癌细胞株HepG2中筛选与RNA结合蛋白人抗原R（Human antigen R，HuR）/类胚胎致死性异常视觉蛋白1（ELAV1）相互作用的长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）分子，并研究HuR蛋白对这些lncRNA分子表达量的影响。　　研究方法:　　1、HuR-RIP实验抽提与HuR蛋白结合的RNA分子并验证RIP实验成功实验分为三组：实验组（HuR）、阳性对照组（SNRNP70）、阴性对照组（Histone H3）,用Western blot法检测HuR蛋白、SNRNP70蛋白、Histone H3蛋白在HepG2细胞中的表达。用正常兔 IgG作为 HuR组和 SNRNP70组的阴性对照，收集HepG2细胞中的RIP蛋白和RNA样本，通过Western blot方法检测蛋白的富集效果。选择特异性引物，用RT-PCR和RT-qPCR的方法检测与蛋白结合的RNA的特异性。　　2、RIP实验后的高通量测序以及生物信息学分析　　（1）RIP实验后抽提RNA，检测RNA的质量；　　（2）制备lncRNA文库，上机测序；　　（3）测序完成后，统计测序样本基本信息、评估测序质量。质量评估合格后，参考基因组回贴。进行转录本重建及预测新的转录本；　　（4）进行基因定量及差异表达分析：用Cuffdiff软件对HuR RIP组和Input组进行 FPKM定量和差异表达分析，之后从差异倍数(log2(Fold change))和校正后的显著水平（p value/q value）两个水平进行评估进行筛选；　　（5）差异表达聚类分析：取差异基因集合中每一个基因在每个样品中的log2(FPKM+0.1)值，用于层次聚类分析。　　3、验证实验　　（1）根据lncRNA的gene ID在Noncode数据库中查阅其类别；　　（2）RIP验证生物信息分析结果；　　（3）通过RNAi实验观察HuR蛋白对lncRNA表达量的影响。　　研究结果:　　1、HuR-RIP实验具有特异性　　（1）蛋白水平：HuR IP下来的蛋白样本只特异性的与HuR抗体结合，与其他无关蛋白的抗体不结合，说明实验所用的HuR RIP抗体特异性较高。另外，HuR IP的上清蛋白中HuR蛋白较少，其他蛋白含量较高，说明细胞裂解液中的大部分HuR蛋白都与HuR抗体结合进而进行免疫沉淀反应了，其他的蛋白因不与HuR抗体结合被留在了IP上清液中；　　（2）RNA水平：阳性对照SNRNP70蛋白特异性与U1 RNA结合，HuR蛋白也与其靶RNA特异性结合。　　2、Input组和HuR-RIP组的RNA浓度和纯度均佳，完整性良好，无污染及降解，适合下一步建库测序。　　3、RNA质量分析后，成功构建了lncRNA文库，并完成测序工作。测序完成之后，先用FastQC对两组测序数据的质量进行评估，整体来看，测序质量良好，可用于下一步的分析。　　4、Reads回帖情况统计：HuR-RIP组的回帖率分别为80.00%、83.20%、80.60%，Input组的回帖率分别为74.40%、73.70%、74.30%。　　5、转录本重构建后统计：HuR-RIP组重构之后转录本的数目分别为58627、59924、54232，Input组重构之后转录本的数目分别为38986、42925、40629。　　6、与HuR蛋白结合基因/转录本个数统计：根据筛选条件，与HuR蛋白结合的coding基因有1075个，与HuR蛋白结合的Long-noncoding基因有361个，与 HuR蛋白结合的novel基因有55个；与HuR蛋白结合的coding转录本有1001个，与HuR蛋白结合的Long-noncoding转录本有351个，与HuR蛋白结合的novel转录本有42个。　　7、与 HuR蛋白结合的 lncRNA类别：本实验经过生物信息学分析找到了HepG2细胞中与HuR蛋白结合的361条lncRNA分子，其中有199条lncRNA属于基因间的lncRNA（Large intergenic noncoding RNA，lincRNA），102条是与外显子正义链有重叠的Exonic lncRNA，18条是与蛋白编码基因在Antisense链上有重叠的 Antisense lncRNA，11条是位于蛋白编码基因的内含子区域的lncRNA（Sense no Exonic），11条预测是Exonic lncRNA或Antisense lncRNA，其余的17条lncRNA在Noncode数据库尚未有定义。　　8、RIP实验验证了20条与HuR蛋白结合的lncRNA分子：从Noncode数据库中筛选Foldchang较大的基因间的长链非编码 RNA（Large intergenic noncoding RNA,LincRNA）和内含子lncRNA，用HuR RIP实验验证HuR蛋白是与这些lncRNA特异性结合的。　　9、HuR对lncRNA表达量影响　　敲低HepG2细胞中的HuR蛋白后，通过RT-qPCR发现，20条lncRNA分子中有11条表达水平明显下降（p﹤0.05），2条lncRNA分子表达水平升高（p﹤0.05）有统计学意义。而剩下的7条lncRNA分子表达量变化不明显，没有统计学意义，说明HuR蛋白可能并不影响这几条lncRNA分子的表达量， HuR蛋白与这些lncRNA分子之间可能存在其他的调控方式。　　研究结论:　　本课题主要是利用RIP-Seq技术筛选 HepG2细胞中与HuR/ELAV1蛋白结合的lncRNA分子。分析时，Fold changes≥2即IP/Input的log2(Fold change)≥1，p value≤0.01，q value≤0.01的基因/转录本被认为是与HuR蛋白结合的基因/转录本。根据此筛选条件找到了361条与HuR蛋白结合的lncRNA分子。敲低HuR蛋白后，一些lncRNA分子表达明显下调，HuR蛋白可能起到稳定这些lncRNA并上调其表达的作用，此外，HuR蛋白也可能调节其中某些lncRNA的亚细胞定位。敲低HuR蛋白后，一些lncRNA分子表达明显上调，说明HuR与这些lncRNA结合后下调这些lncRNA表达，中间可能有其它分子参与。