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目的:骨关节炎(OA)是最常见的一种以关节软骨退变为特征的关节疾患,目前尚缺乏经济且有效的治疗方法。本研究拟应用威灵仙注射液(WLX)干预体外培养关节软骨细胞和 OA 模型动物,通过检测细胞因子 IL-1β、胶原和蛋白多糖表型在细胞和分子水平的变化,以及 OA 关节软骨组织学和超微结构的改变,探讨 WLX 治疗 OA 的可能机制,为临床进一步开发应用 WLX 防治 OA 寻找和奠定理论基础。材料与方法:1.体外实验部分 获取兔关节软骨细胞行体外单层细胞培养,第二代传代细胞接种于 25cm2培养瓶和预置盖玻片的 24 孔培养板,分三组刺激干预:I 组细胞分别以不同浓度 WLX[ 0.00(空白)、0.075mg/mL、0.15mg/mL、0.30mg/mL、0.60mg/mL、1.25mg/mL、2.50mg/mL ]干预 72 小时;Ⅱ 组先予上述不同浓度WLX干预24小时,再予10ug/mL脂多糖(LPS)刺激72小时;ⅡI组则先以10ug/mL的 LPS 刺激 24 小时,再予上述不同浓度 WLX 干预 72 小时。干预 72 小时后收集三组细胞的培养上清液,放免法(RIA)测定 IL-1β水平;收集培养瓶中的软骨细胞,应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测三组软骨细胞 IL-1βmRNA和 I、Ⅱ 型前胶原 mRNA 的表达水平。倒置显微镜下观察 24 孔培养板中预置的盖玻片铺满软骨细胞后取出,固定、漂洗,免疫细胞化学法(ICC)检测比较三组软骨细胞 I、Ⅱ 型胶原的表达情况;应用甲苯胺蓝染色,观察三组软骨细胞和基质的异染情况。2.体内实验部分 45 只健康成年新西兰白兔随机分为三组(S 组、D 组、K 组),以右膝为实验侧,按 Hulth-Talhag 法造 OA 模型,术后第二天起分组用药干预。按 Meer-Rubner 公式计算用药量,连续肌肉注射用药 4 周,S 组用 WLX 0.4mL/d,D 组用生理盐水(NS)0.4mL/d,K 组空白。分别于术后 6、12、24 周三个时点每组各随机处死 5 只获取右膝关节标本:摄 X 线正侧位片,手术显微镜观察行软骨显微解剖学分级;每具标本获取关节液 200μl,RIA 法测定比较 IL-1β水平 ;软骨标本石蜡包埋,作 5μm 超薄切片,HE/SOFG 组化染色并 Mankin 评分,比较各组关节软骨组织-组化水平的损伤程度;免疫组化(IHC)法检测比较各组关节软骨基质 I、Ⅱ 型胶原的表达情况;切取每兔右侧股骨髁负重关节面 1×1×1mm3软骨,透射电镜(TEM)观察比较各组关节软骨超微结构变化。 2<WP=7>结果:1.体外部分:细胞培养:倒置显微镜下可见原代细胞接种后 24 小时开始贴壁,72 小时后完全贴壁,细胞呈圆形、椭圆形或上皮细胞样外观,10-14 天铺满瓶底形成单层,部分区域可呈集落样生长或多层生长。传代培养的软骨细胞 24-48 小时完全贴壁,5-7 天可达到亚融合状态。低浓度 WLX 干预 72h 的细胞生长情况良好;LPS 刺激 72h 的细胞密度减低,并可见梭形细胞;LPS 刺激并应用 WLX 干预的细胞生长无明显异常。三代以后的传代细胞中梭形细胞增多,分泌和增殖能力下降,传代周期延长。培养上清 IL-1β水平的比较:组间比较,WLX 浓度为 0 时,I 组和 Ⅱ、ⅡI 组间差别均有显著意义(P<0.01),Ⅱ、ⅡI 两组间差别没有统计学意义(P>0.05);其余各浓度 WLX 干预的细胞 I、Ⅱ、ⅡI 组间差别均无显著意义(P>0.05)。 组内比较,I 组在各浓度时差别无显著意义(P>0.05);Ⅱ、ⅡI 组 WLX 浓度为 0 时与其它各浓度(0.075mg/mL~2.50 mg/mL )时的 IL-1β水平差别有统计学意义(P<0.05), 其余各浓度之间 IL-1β水平差别无显著意义(P>0.05)。RT-PCR 结果:正常软骨细胞以及 WLX 干预的软骨细胞可低水平表达IL-1βmRNA,经 LPS 刺激的软骨细胞在 WLX 浓度为 0 时,IL-1βmRNA 呈强阳性表达,其余各浓度 WLX 干预组 IL-1βmRNA 低水平表达。正常软骨细胞不表达 I 型前胶原 mRNA;经 LPS 刺激的软骨细胞在 WLX 浓度为 0 时可低水平表达I 型前胶原 mRNA;其余各浓度 WLX 干预的软骨细胞不表达或极低水平表达 I型前胶原 mRNA。正常软骨细胞表达 Ⅱ 型前胶原;LPS 刺激的软骨细胞 Ⅱ 型前胶原 mRNA 表达水平降低,应用 WLX 干预后表达水平恢复。ICC 结果:免疫细胞化学染色显示,正常关节软骨细胞不表达 I 型胶原,经 LPS刺激的软骨细胞可低水平表达 I 型胶原,应用 WLX 干预后 I 型胶原表达水平显著降低。正常软骨细胞表达 Ⅱ 型胶原;LPS 刺激后软骨细胞 Ⅱ 型胶原表达水平降低,应用 WLX 干预后 Ⅱ 型胶原表达水平恢复。组化染色结果:甲苯胺蓝染色显示,正常关节软骨细胞正染成浅蓝色,核仁呈深蓝色;集落样生长区细胞和细胞外基质异染成紫红色,核正染成深蓝色。经 LPS刺激的软骨细胞在 WLX 浓度为 0 时甲苯胺蓝染色以浅蓝色为主,部分细胞呈核负染,ECM 染色变浅,应用低浓度 WLX 干预后细胞染色和正常软骨细胞接近。2.体内部分:X 片和显微观察结果:X 线平片结果显示,S 组在 6 周时关节面光滑平整,关节间隙正常、对称、无软骨下骨硬化和骨赘形成;12 周时内侧关节间隙稍变窄, 3<WP=8>软骨下骨硬化,密度稍增高,未见明显骨赘形成;24 周时可见典型 OA 表现,关节面不平整,内侧关节间隙狭窄,软骨下骨硬化,有骨赘形成。D ?