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阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种常见的中枢神经系统（central nervous system,CNS）退行性疾病,AD疾病的发病人数逐年递增,成为越来越常见的CNS疾病,而用于治疗AD疾病的新药开发却受到许多因素的制约,其中最主要的因素就是药物如何跨血脑屏障（blood brain barrier,BBB）进入脑内。口服或注射等全身给药后,几乎所有的大分子药物和水溶性小分子药物都不能进入CNS,成为CNS疾病治疗的瓶颈。而颅内药物转运或化学方法将水溶性小分子脂化等传统的跨BBB转运方法,存在很多弊端和缺陷。鼻-脑途径,被认为是一种很有前途的药物靶向大脑的策略,用以治疗不同的CNS疾病。另外,随着药剂学的发展,基于纳米技术的药剂学方法,在鼻腔给药跨BBB方面的优越性引起了人们的兴趣。如:纳米乳（Nanoemulsion,NE）递药系统,具有较高的鼻-脑转运效率。但纳米递药系统跨BBB的鼻-脑转运机制尚有争论。石杉碱甲（Huperzine A,HupA）是一种可逆性胆碱酯酶抑制剂,可用于治疗AD引起的良性记忆障碍及老年性痴呆。目前,临床上应用较多的是石杉碱甲片剂、胶囊剂和石杉碱甲注射剂。口服给药引起恶心、呕吐、腹泻等胃肠道症状以及出汗、失眠、视物模糊等外周胆碱能副作用,同时易产生首过效应而影响药效;注射给药给患者带来极大的痛苦和不便。为了突破脑部疾病治疗的瓶颈,实现鼻-脑靶向治疗,提高AD的临床治疗效果,本论文以治疗AD的中药石杉碱甲（HupA）为模型药物,设计优化了纳米鼻腔递药系统,并以靶向功能分子乳铁蛋白（lactoferrin,Lf）对NE进行修饰,制备了具有脑靶向性的乳铁蛋白-石杉碱甲-纳米乳（Lf-HupA-NE）。并对纳米递药系统在体外细胞和体内动物水平进行较全面的研究。本论文主要分为以下七部分:第一部分建立HupA在体内和体外测定的方法学。采用高效液相色谱定量法测定,方法的专属性强、精密度好、回收率高,具有稳定性,结果准确可信,结论可靠。第二部分筛选和优化纳米乳处方。选择具有适宜HLB值的表面活性剂和助表面活性剂,且根据HupA脂溶性的特点,测定并筛选对HupA溶解性良好的辅料组分。溶解度试验结果表明HupA在表面活性剂Cremophor EL、助表面活性剂Labrasol/PEG400和油相Capryol90/L.A.S中溶解度较好。IPM作为小分子油相与亲水性的表面活性剂相互渗透能力强,容易形成纳米乳,因此选择高溶解性油相和IPM混合作为混合油相。上述辅料分别组成体系,采用机械搅拌法筛选有转相过程和蓝色荧光的体系为纳米乳组份。确定纳米乳处方为:Capryol 90与IPM的混合油相,表面活性剂Cremophor EL,助表面活性剂Labrasol。以油相、表面活性剂和助表面活性剂组成的混合表面活性剂（Smix）及水相为三个顶点,根据油相和Smix的不同比例,以及临界点的含水量,绘制伪三元相图,伪三元相图的面积越大形成纳米乳的区域越大。表面活性剂与助表面活性剂的比值Km为2:1时所围成的伪三元相图的面积最大。利用Box-Behnken设计和响应面法对处方各组分比例进一步优化,最终确定纳米乳的处方为3.00%IPM、3.81%Capryol90、40%Cremophor EL+Labrasol和53.19%水。第三部分Lf修饰的HupA-NE给药系统的制备、质量评价、体外释放及稳定性评价。基于三元相图和响应面法优化的处方设计制备纳米乳给药系统,利用带正电荷的靶向功能分子Lf通过静电吸附修饰到带负电荷的纳米乳表面得到Lf-HupA-NE。染色法判断制备的纳米乳为O/W类型。马尔文粒度检测仪测得HupA-NE的粒径、PDI和Zeta电位分别为15.24±0.67nm、0.128±0.074和-8.06±0.53mV;Lf-HupA-NE的粒径、PDI和Zeta电位分别为16.78±0.4nm、0.038±0.028和+5.67±0.39mV。透射电镜观察纳米乳形态HupA-NE和Lf-HupA-NE外观均呈圆球形、分布均匀,大小基本与粒径仪测定结果一致。HupA-NE的载药量为0.49±0.024%,即4.94±0.127mg·mL-1;Lf-HupA-NE的中HupA含量约为4.87±0.239mg·mL-1。体外释放试验结果表明两种纳米乳与药物水溶性相比均可提高药物的释放量。测得HupA-NE和Lf-HupA-NE的pH值分别为5.75和6.15,在文献报道的鼻腔正常pH（5.5-6.5）范围内,可减少对鼻粘膜的刺激或损伤。本研究制备出的HupA-NE和Lf-HupA-NE给药系统质量稳定,满足鼻腔给药纳米乳给药系统的质量要求。第四部分细胞实验探讨NE跨BBB的机制。选用永生化人脑微血管内皮细胞（hCMEC/D3）建立体外BBB模型,通过试漏实验和监测跨膜电阻确定体外BBB模型建立成功。采用MTT法考察HupA-NE,Lf-HupA-NE和HupA水溶液,对hCMEC/D3细胞的毒性。浓度范围0.1-10μg·mL-1在24h之内对hCMEC/D3细胞无明显毒性。通过Western Blot方法证明hCMEC/D3细胞上存在P-gp、MRP1、BCRP三种外排蛋白,且加入外排蛋白相应的抑制剂后可提高细胞内HupA含量。与HupA水溶液相比,两种纳米乳HupA-NE和Lf-HupA-NE作用后细胞中HupA的提高程度低。一方面说明HupA通过这三种外排蛋白转运;另一方面与免疫组化分析试验结合起来共同得出纳米乳制剂具有一定的抑制外排蛋白的作用。摄取抑制实验的结果初步证实HupA-NE和Lf-HupA-NE经低密度脂蛋白受体相关蛋白（low-density lipoprotein receptor-related protein,LRP）介导,网格蛋白以及巨胞饮内吞途径被摄取;修饰了Lf的纳米乳,还通过Lf相关受体介导的内吞途径进入细胞跨越BBB。第五部分SD大鼠鼻腔给HupA-NE和Lf-HupA-NE后,采用鼻粘膜HE染色法观察到两种纳米乳对鼻粘膜无刺激性。采用遇水荧光淬灭的水敏感型荧光探针P2追踪完整纳米乳经鼻腔给予后在脑内的递药特性。手术建立嗅神经阻断大鼠模型,切断鼻-脑的嗅神经直接通路,纳米乳在脑内仍然能检测到,但在脑内的分布范围和强度均低于非手术组,表明嗅神经通路为主要途径。包载HupA的完整纳米乳鼻腔给药后,推测纳米乳经鼻给药后,可通过嗅神经通路绕过血脑屏障途径和经鼻粘膜吸收进入全身循环后跨血脑屏障两条路径进入脑内。第六部分考察纳米乳在大鼠脑内分布。以罗丹明B（RhB）为荧光探针,用化学合成的方法制备化合物RhB-HupA,红外光谱法验证荧光染料RhB和药物HupA通过羧酸与氨基反应相连接。将连接了荧光探针的RhB-HupA-NE和Lf-RhB-HupA-NE经鼻腔给药,脑组织冰冻切片显示纳米乳递药系统相比于药物水溶液脑内RhB-HupA的红色荧光分布显著增多,Lf-RhB-HupA-NE在脑内的分布高于RhB-HupA-NE。结果表明经鼻给药纳米乳制剂可提高脑内的药量,Lf介导的纳米乳大大提高了药物转运入脑,与预期结果一致。第七部分石杉碱甲纳米乳递药系统在大鼠体内药动学及靶向性评价。以临床使用的HupA片剂作为对照,采用药动学方法考察了HupA-NE和Lf-HupA-NE纳米系统在大鼠脑内递药的特性。大鼠鼻腔给予HupA-NE和Lf-HupA-NE,HupA水溶液灌胃,HPLC法定量测定各时间点大鼠血浆及各组织中HupA的浓度,用DAS 2.0软件计算药动学参数。在脑组织中,纳米乳制剂的AUC（0-t）明显大于口服的药物溶液且Lf-HupA-NE>HupA-NE>HupA水溶液;达峰浓度Lf-HupA-NE>HupA-NE>HupA水溶液;体内滞留时间Lf-HupA-NE>HupA-NE>HupA水溶液;半衰期Lf-HupA-NE>HupA-NE>HupA水溶液;清除率Lf-HupA-NE<HupA-NE<HupA水溶液;说明鼻腔给药纳米乳递药系统可提高HupA进入脑内的量,且达到了缓释的目的并延长脑内作用时间。Lf-HupA-NE改进效果更显著,Lf受体介导的跨BBB转运功能更利于Lf修饰的纳米递药系统在脑组织浓集。在其它组织中,纳米乳制剂可降低心、肝、肾达峰浓度,减少心、肝、肾的毒性。纳米乳制剂在肝、肾清除速率快。采用峰浓度比Ce和相对摄取率Re评价纳米乳的脑靶向性。Ce和Re均大于1,表明相比于口服灌胃溶液组,经鼻纳米乳递药系统可增加HupA在脑内分布,具有一定脑靶向性。Lf作为靶向功能分子构建的Lf-HupA-NE靶向指数DTI为2.61,表明Lf修饰的石杉碱甲纳米乳具有较好的脑靶向性。综上所述,论文成功构建了Lf修饰的Lf-HupA-NE的纳米载药系统,经鼻腔给药可有效提高药物到达脑内的浓度,初步推测跨BBB的机制。本研究结果为AD等脑部疾病的治疗药物研究提供了新思路。