【摘 要】
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基于扩增的数字化基因定量检测技术可实现核酸分子的高特异性、高灵敏度绝对定量,在临床医学及生命科学研究中具有重要的研究价值。与液滴微流控技术相结合,数字LAMP技术无需精密的温度循环过程,在恒温条件下即可完成目的核酸分子的指数级扩增,在核酸分子的现场快速定量检测中具有广阔的应用前景。在液滴微流控样品划分中,阶梯乳化由于其所生成液滴尺寸主要依赖于微通道的几何参数,具有对驱动流速不敏感、易集成等优势,特
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基于扩增的数字化基因定量检测技术可实现核酸分子的高特异性、高灵敏度绝对定量,在临床医学及生命科学研究中具有重要的研究价值。与液滴微流控技术相结合,数字LAMP技术无需精密的温度循环过程,在恒温条件下即可完成目的核酸分子的指数级扩增,在核酸分子的现场快速定量检测中具有广阔的应用前景。在液滴微流控样品划分中,阶梯乳化由于其所生成液滴尺寸主要依赖于微通道的几何参数,具有对驱动流速不敏感、易集成等优势,特别是离心式阶梯乳化通过巧妙的结构设计只需单一离心力即可完成单分散液滴的高通量生成,极大减低系统及操作的复杂程度。本文立足于生物信息精密测量领域中核酸分子的绝对定量检测,对基于离心式阶梯乳化微流控芯片的液滴数字LAMP技术进行研究,完成离心式阶梯乳化微流控芯片设计、液滴数字LAMP系统构建以及SARS-CoV-2 N基因的定量检测。本论文的具体研究内容如下:(1)分析阶梯乳化液滴生成机制及液滴直径、液滴生成状态的影响因素,针对液滴数字LAMP的样品划分需求,设计离心式阶梯乳化微流控芯片的通道结构参数,测试离心转速与通道结构对于所生成液滴直径及均匀性的影响,实现单分散液滴的稳定生成。(2)为抑制LAMP反应过程中恒温加热导致的油相损耗与液滴融合,通过设计三层式结构的微流控芯片来改变PDMS的透气性及改进芯片的密封性,保证液滴数字LAMP的稳定进行。(3)以离心式阶梯乳化微流控芯片为液滴生成器件,以离心进样仪为液滴生成仪器,以平板PCR仪为恒温扩增仪器,以荧光显微镜为荧光成像仪器,构建液滴数字LAMP系统,实现LAMP反应体系的片上液滴生成、扩增及定量检测。(4)针对COVID-19精确、快速诊断的技术及仪器需求,设计SARS-CoV-2 N基因的引物序列构建LAMP反应体系,并测试扩增效率与特异性,进而利用离心式阶梯乳化微流控芯片实现SARS-CoV-2 N基因的液滴数字LAMP定量检测。
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