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马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是严重危害茄科作物的一种病毒,揭示马铃薯Y病毒与寄主的互作关系将为研究马铃薯Y病毒的致病机理及有效控制提供理论依据。本课题组在前期的工作中从山西烟草根际土壤中分离得到一株对马铃薯Y病毒具有钝化效果的细菌,经16S r RNA及Biolog Micro Plate鉴定为黏质沙雷氏菌(Serratia marcescen-S3)。通过蛋白质组学及泛素化组学联合分析,初步筛选出Nb Hsc70-2蛋白,推测该蛋白泛素化修饰在Serratia marcescen-S3抗病毒诱导抗性作用机制中可能起重要作用,本研究通过多种生物化学与分子生物学方法,进一步揭示寄主Nb Hsc70-2蛋白的泛素化修饰在黏质沙雷氏菌S3诱导抗性中的作用机理,主要研究结果如下:(1)黏质沙雷氏菌S3是一株具有抗病毒生物活性的细菌菌株,在1.0×10~9CFU/m L条件下对马铃薯Y病毒抑制作用可达到100%,以S3菌株处理的本氏烟为目标材料,选取了S3防治马铃薯Y病毒最佳反应时间点,通过非标定量技术、高效液相色谱分级技术、泛素化肽段的富集技术以及基于质谱的定量蛋白质组学技术等一系列前沿技术的有机结合,对烟草叶片中定量蛋白组及泛素化非标定量组学进行了研究,通过蛋白组及泛素化组联合分析发现Nb Hsc70-2在S3处理后蛋白水平显著下调,而该蛋白的泛素化水平显著上调。暗示Nb Hsc70-2的泛素化修饰在S3诱导抗性作用机制中可能扮演一个重要的角色。利用Western blot技术验证该组学数据的真实性,结果显示S3处理本氏烟后整体泛素化水平上升,同时寄主中Nb Hsc70-2蛋白水平发生下降,这与组学分析结果一致,表明组学数据是可信的,并且S3处理植株抑制寄主体内Nb Hsc70-2蛋白的表达。(2)通过q RT-PCR、Western blot等技术分析马铃薯Y病毒侵染对Nb Hsc70-2的影响,结果显示马铃薯Y病毒侵染会引起寄主中Nb Hsc70-2 m RNA及蛋白水平的上调。进一步利用病毒介导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)、瞬时过表达等方法证明Nb Hsc70-2对植物生长发育中具有重要作用,并且Nb Hsc70-2在马铃薯Y病毒侵染复制过程中具有重要的促进作用。(3)利用泛素化抑制剂MG-132抑制寄主体内的泛素化修饰,探究泛素化在S3抗病毒病的作用机制中的作用,结果显示S3诱导抗性是通过抑制Nb Hsc70-2蛋白的表达来达到抗病毒效果。抑制寄主泛素化修饰水平则抑制Nb Hsc70-2介导的S3抗病毒抗性,说明Nb Hsc70-2的泛素化修饰可能在S3抗病毒抗性作用机制中起重要作用。根据上述结果得出结论:马铃薯Y病毒侵染本氏烟后通过招募寄主因子Nb Hsc70-2来促进自身的复制侵染,S3处理可抑制该过程中Nb Hsc70-2的表达,并且在S3的诱导抗性作用机制中Nb Hsc70-2的下调可能是由于S3处理后Nb Hsc70-2的泛素化水平升高导致的,进而植株获得抗病毒活性。