目的甲状腺癌是比较少见的由特异性染色体异位、嵌合、基因融合及突变而引起的上皮细胞恶性肿瘤。其中乳头状甲状腺癌(PTC)为分化型甲状腺癌,占甲状腺癌的80%。尽管包括PTC在内的分化型甲状腺癌恶性度较低并且高度可愈,但是此类肿瘤在初次治疗后的复发率很高,这是由于甲状腺特异性蛋白包括基底膜上的钠／碘协同转运体(NIS)和顶膜上的Pendrin蛋白及促甲状腺激素受体(TSHR)的表达的缺失或功能发生异常。有研究表明DNA甲基化可能是导致肿瘤组织中某种蛋白表达减少或功能异常的一个原因,最终使放射性碘治疗的无效。最近研究发现的BRAF基因与PTC关系较为密切,MarineN等在对320例甲状腺肿瘤及6个未分化癌细胞株进行突变检测发现在低分化和未分化癌中也有BRAF基因突变。随后,还有不少学者比较了各种甲状腺癌中BRAF基因的突变率发现PTC中BRAF基因的突变率可高达83%,未分化癌中的突变率达35%,其它类型甲状腺癌中均未见突变,提示散发性成年人PTC的BRAF基因突变率高,具有BRAF基因T1799A突变热点。综上提示BRAF基因突变可能与PTC的转移与预后密切相关。BRAF基因突变可能还影响到对甲状腺癌的治疗策略。甲状腺癌对常规化疗药物不敏感,且后者副作用大。因此,研制新型抗癌药物就显得尤为重要。最近发现在我国传统中草药莪术的根茎中可以提取一种不具细胞毒性的抗肿瘤药物p-榄香烯,它的低毒性和抗肿瘤的广谱性得到了医生和患者的广泛接受。但目前β-榄香烯对甲状腺癌的治疗效应及机制研究尚浅。本研究的目的是在PTC中与碘代谢密切相关的TSHR和NIS的蛋白表达及TSHR和NIS基因甲基化和BRAF基因T1799A突变,分析遗传学改变与TSHR和NIS蛋白的表达关系。进一步研究在体内和体外情况下p-榄香烯对人乳头状甲状腺癌IHH-4细胞系和未分化甲状腺癌ASH-3细胞系的效应和作用机制。方法一、研究对象研究病例来自2005年至2006年在滨州人民医院行甲状腺全切术的PTC患者(n=60),其中男性12例,女性48例,年龄26-66岁,平均年龄44岁。人类乳头状甲状腺癌IHH-4细胞系人类未分化甲状腺癌ASH-3细胞系6周龄雄性BALB/c裸鼠二、研究方法1、甲状腺乳头状癌病例标本中BRAF基因T1799A突变检测提取癌组织切片中的基因组DNA,应用聚合酶链反应(PCR)对标本DNA BRAF基因的第15外显子进行扩增后,对基因测序。2、甲状腺乳头状癌病例标本中的TSHR和NIS蛋白表达和甲基化检测TSHR和NIS蛋白表达直接进行免疫组化染色；甲基化分析是提取癌组织切片中的基因组DNA, DNA重亚硫酸盐处理,针对TSHR和NIS基因甲基化的特异性PCR。3、p-榄香烯对人类乳头状甲状腺癌IHH-4细胞系和未分化甲状腺癌ASH-3细胞系增殖及对细胞周期的影响检测,IHH-4细胞系细胞周期调节蛋白水平检测。增殖能力的研究在体外是通过MTT比色分析方法进行测定的。应用流式细胞仪对IHH-4和ASH-3细胞系细胞周期进行分析。使用western印记分析法检测细胞周期调节蛋白。4、p-榄香烯诱导人类乳头状甲状腺癌IHH-4细胞系的凋亡及凋亡调节蛋白水平和活性检测。使用TUNEL检测法分析判断p-榄香烯对IHH-4细胞系诱导凋亡作用,选用抗caspases-8、caspases-9和Bcl-2的抗体做免疫印记分析凋亡蛋白的水平和活性。5、Matrigel侵袭实验在体外情况下β-榄香烯对人类乳头状甲状腺癌IHH-4细胞系移动性的作用。6、p-榄香烯对荷瘤BALB/c裸鼠肿瘤的影响检测包括对荷瘤BALB/c裸鼠肿瘤体积、生存率的检测,及对体内的细胞周期调节蛋白及VEGF检测。三、统计学处理分类数据采用频率和百分数表示,连续变量应用均数±标准差表示。分类变量的统计应用x2检验,连续变量的统计应用t检验。p值采用双侧检验,以p<0.05为有统计学差异。采用SPSS软件(11.5版本),进行数据分析。结果一、PTC中TSHR、NIS基因甲基化和蛋白表达及其与BRAF基因T1799A突变情况1、PTC标本中BRAF基因T1799A突变状况60例PTC标本中,BRAF基因T1799A突变率为65%(n=39)。突变与临床病理特征未见显著关联。20例癌对侧非癌甲状腺组织中,未检出BRAF基因突变。2、PTC标本中TSHR和NIS蛋白的表达癌对侧的甲状腺组织(阳性对照)中,TSHR阳性颗粒分布于约70%的甲状腺滤泡上皮细胞的胞浆和胞膜上,显色程度中到强。全部被检测的PTC标本中,均可见到TSHR阳性颗粒显色：57%(n=34)的标本TSHR呈现散在或弥漫性的胞浆淡染,35%(n=21)可见到与癌对侧组织染色强度和分布类似的阳性显色,8%(n=5)的标本染色强度高于癌对侧组织。癌对侧的甲状腺组织(阳性对照)中,NIS阳性颗粒分布于约20%的甲状腺滤泡上皮细胞的胞浆和胞膜上,显色程度强。全部被检测的PTC标本中,除1例外均可见到NIS阳性颗粒显色,但显色强度较阳性对照明显为弱,仅有5%(n=3)的标本可见到与癌对侧组织染色强度和分布类似的阳性显色。3、PTC标本中的TSHR和NIS基因甲基化状况60例PTC标本中,TSHR和NIS基因甲基化的发生率分别为43%(n=26)和27%(n=16)。上述基因的甲基化与某些临床病理特征有相关的趋势,但没有统计学意义。20例癌对侧非癌甲状腺组织中,未检出上述基因甲基化。二、p-榄香烯对PTC作用机制的体外研究1、p-榄香烯对IHH-4及ASH-3细胞增殖及对细胞周期调节蛋白水平影响。β-榄香烯对ASH-3和IHH-4细胞具有显著的抑制细胞增殖的作用,在20μg/ml到60μg/ml的浓度范围内其抑制作用呈现明显的剂量依赖性关系。应用流式细胞仪对IHH-4和ASH-3细胞的细胞周期进行了分析。结果显示,用30、40和50μg／ml的β-榄香烯处理IHH-4细胞后,处于细胞周期G1期中的细胞比例明显增加。而经过β-榄香烯处理后的ASH-3细胞G1期细胞数量没有显著增加。细胞周期中G1期是受细胞周期调节蛋白E、CDK2和CDK6等的调节。实验结果显示,用不同浓度的β-榄香烯处理IHH-4细胞系后,细胞中cyclin E、CDK2和CDK6的表达水平下降。2、p-榄香烯对IHH-4细胞凋亡的诱导作用及凋亡调节蛋白水平和活性的影响。结果显示,未经处理的对照细胞很少发生凋亡,而随着β-榄香烯浓度的增加,凋亡细胞数量也随之增加。因此,同未经处理的对照细胞相比,β-榄香烯以剂量依赖的方式在48小时处引起了凋亡的IHH-4细胞显著增加。凋亡调节蛋白水平及活性的实验结果显示,Bcl-2的表达降低,caspases-9裂解蛋白的水平以剂量依赖的方式升高。另外,caspases-8水平未见改变。3、p-榄香烯对IHH-4细胞移动性的作用。Matrigel侵袭实验结果显示,虽然我们在细胞增殖实验中已经证实,在极低浓度(10μg/ml)下,p-榄香烯对IHH-4细胞的增殖无明显抑制作用,但在此浓度下p-榄香烯仍然对IHH-4细胞的移动性具有明显的抑制作用。三、β-榄香烯对PTC作用机制的动物实验1、β-榄香烯对荷瘤BALB/c裸鼠肿瘤体积的影响结果显示β-榄香烯治疗组荷瘤裸鼠的肿瘤体积明显小于空白乳剂组(p＜0.05),说明在体内情况下β-榄香烯对PTC的生长有明显抑制作用。2、β-榄香烯对荷瘤BALB/c裸鼠生存率的影响从给药后第7天开始,β-榄香烯治疗组(50mg/kg)的荷瘤BALB/c裸鼠的生存率明显高于空白乳剂组(p<0.01),说明在体内情况下β-榄香烯通过抑制PTC的生长,来提高荷瘤裸鼠的生存率。3、β-榄香烯在体内情况下对细胞周期调节蛋白及VEGF的影响经β-榄香烯治疗(50mg/kg)后,肿瘤组织中的cyclin E和CDK6的表达水平下降,提示在体内情况下β-榄香烯也能通过调控cyclin E和CDK6的表达,导致IHH-4细胞阻滞于细胞周期的G1期。此外,经β-榄香烯治疗后,VEGF蛋白的表达水平下降,提示肿瘤组织中的血管新生受到抑制。结论1、免疫组织化学染色提示PTC组织中TSHR和NIS蛋白表达异常,与相应基因的甲基化发生有关,亦与BRAF基因T1799A突变的发生有关。提示：PTC中相应基因的甲基化和BRAF基因突变可能是TSHR和NIS蛋白表达减弱并分布异常的原因。TSHR和NIS基因甲基化与BRAF基因突变相关,可能是BRAF基因突变导致肿瘤恶性程度增高的内在机制之一2、β-榄香烯对PTC具有明显的治疗作用,其作用机制是通过阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡和抑制肿瘤细胞侵袭而实现的。