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目的：通过检测CD4+CD25T细胞和CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)在缺氧条件下Foxp3和缺氧诱导的转录因子la(hypoxia inducible factor-1α, HIF1α)表达水平的变化,及HIF1α对Foxp3表达的影响,探讨缺氧是否通过HIF1α来调控Foxp3,并为肿瘤微环境中Foxp3表达上调、Treg数量增多及由此引发的肿瘤细胞免疫逃逸提供理论依据。方法：1.免疫磁珠法从人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中分离CD4+CD25T细胞和Treg。采用1%02、5%C02培养方法建立缺氧培养模型。将分离的CD4+CD25T细胞和Treg进行缺氧培养和常氧培养,通过流式细胞术、Real-time PCR、Western Blot检测CD4+CD25T细胞在缺氧和非缺氧条件下Foxp3mRNA及蛋白的表达,采用Real-time PCR、 Western Blot观察Treg在缺氧和非缺氧条件下FoxP3mRNA及蛋白的表达。2.将分离得到的CD4+CD25T细胞和Treg进行缺氧培养和常氧培养,通过免疫荧光、Real-time PCR、 Western Blot观察缺氧和非缺氧环境下CD4+CD25T细胞和Treg中HIF1α mRNA及蛋白的表达。3.制备过表达HIF1α的慢病毒HIF-lenti,感染CD4+CD25T细胞。用流式细胞术、Real-time PCR和Western Blot检测HIF1α与Foxp3的mRNA和蛋白水平,以了解过表达HIF1α对CD4+CD25T细胞Foxp3表达的影响。4.制备HIF1α的RNA干扰慢病毒siHIF-lenti,在缺氧条件下感染CD4+CD25T细胞,以敲低其HIFla的水平。用流式细胞术、Real-time PCR和Western Blot检测缺氧条件下HIF1α表达被沉默后对Foxp3表达的影响。5.构建Foxp3启动子-PGL3及PGL4.73-[hRluc/TK]组成的双萤光素酶报告基因系统,与HA-HIF1α-P402A/P564A-PCDNA3质粒共转染入Jurkat T细胞,通过荧光检测HIF1α过表达对Foxp3启动子转录活性的影响。6.将Foxp3启动子双萤光素酶报告基因系统与HIF1α的RNA-扰粒siHIF共转染入JurkatT细胞,荧光分光光度计检测在缺氧条件下,HIF1α干扰对Foxp3启动子转录活性的影响。7.构建Foxp3增强子-PGL3及PGL4.73-[hRluc/TK]组成的双萤光素酶报告基因系统,与HA-HIF1α-P402A/P564A-PCDNA3质粒共转染入Jurkat T细胞,荧光分光光度计检测在常氧条件下,HIFla过表达对Foxp3增强子转录活性的影响。8.将Foxp3增强子双萤光素酶报告基因系统与RNA干扰质粒siHIF共转染入Jurkat T细胞,荧光分光光度计检测缺氧条件下HIF1α干扰对Foxp3增强子转录活性的影响。结果：1.缺氧条件下,CD4+CD25T细胞Foxp3和HIF1α的mRNA和蛋白水平均明显升高,与非缺氧组相比P<0.05。而缺氧环境中虽也使Treg的HIF1α表达水平升高,但对Foxp3的表达无显著影响。2.常氧条件下,过表达HIF1α使CD4+CD25-T细胞Foxp3mRNA和蛋白水平提高,与空载组相比P<0.05。3.缺氧条件下,利用RNA干扰技术,敲低CD4+CD25T细胞的HIF1α表达水平,其Foxp3蛋白和mRNA水平也相应降低,与空载体对照组相比P<0.05。4.常氧条件下,Jurkat T细胞过表达HIF1α,不能提高Foxp3启动子活性,与空载体对照组相比P>0.05。5.缺氧条件下,Jurkat T细胞敲低HIF1α,对Foxp3启动子活性无影响,与空载体对照组相比P>0.05。6.在常氧条件下,Jurkat T细胞过表达HIF1α,可显著提高其Foxp3增强子活性,与空载对照组相比P<0.01。7.在缺氧条件下,利用HIF1α的RNA干扰质粒siHIF敲低Jurkat T细胞HIF1α的表达水平,对Foxp3增强子活性有明显抑制作用,与空载对照组相比P<0.05。结论：缺氧使CD4+CD25T细胞和Treg细胞的HIF1α表达均上调,使CD4+CD25T细胞的Foxp3高表达,对Treg的Foxp3却没有影响。缺氧对CD4+CD25T细胞Foxp3的上调机制可能在于通过HIF1α促进其Foxp3增强子活性,进而促进Foxp3的转录,这可能是肿瘤缺氧微环境内CD4+CD25T细胞向Treg转化的原因之一。