顺铂作为临床上广泛使用的抗肿瘤化疗药物,其最主要副作用为以急性肾损伤(AKI)为主要表现的肾毒性。单次顺铂治疗的患者中有25-35%患者发生AKI。顺铂的肾毒性降低肿瘤患者的生存质量,使患者不得不减少顺铂用量甚至停止治疗。目前对顺铂致AKI发病机制的研究显示:顺铂所致肾组织内无菌性炎症反应是顺铂致AKI的主要机制。顺铂在肾小管上皮细胞内的蓄积诱导肾小管上皮细胞凋亡甚至坏死,存在于肾小管间质内的单核巨噬细胞在小管上皮细胞损伤后几小时内即可趋化至损伤的肾小管上皮细胞周围,释放促炎症因子及趋化因子造成肾小管上皮细胞进一步损伤。但对于在顺铂致AK1过程中单核巨噬细胞的激活机制及其与肾小管上皮细胞损伤间的关系尚缺乏深入的研究。顺铂致肾小管上皮细胞坏死后可释放出损伤相关的分子模式(DAMP),DAMP可激活固有免疫系统,单核巨噬细胞作为固有免疫系统中重要的免疫细胞,在胞膜及胞内分布有可识别DAMP的类型识别受体(PRR)。NOD样受体(NLR)是一种存在于单核巨噬细胞胞内的PRR,NLR与转换分子蛋白ASC及半胱氨酸蛋白酶caspase-I组成NLRP3炎症小体,DAMP作用于单核巨噬细胞NLR后可激活NLRP3炎症小体中的caspase-1,生成IL-1β及IL-18。动物实验已证实敲除caspase-1基因及阻断IL-18可减轻包括顺铂等病因所致的AK1,这提示顺铂致AKI过程中单核巨噬细胞内NLRP3炎症小体激活可能是一种重要的损伤机制。在缺血再灌注所致AKI研究中已证实阻断DAMP的作用可减轻肾小管上皮细胞损伤。肾小管上皮细胞与单核巨噬细胞共培养研究中也证实上皮细胞可通过释放免疫调节因子调控单核巨噬细胞的激活。化疗药物诱导肿瘤细胞坏死后可释放DAMP,激活单核巨噬细胞攻击肿瘤细胞。上述研究从不同角度提示顺铂损伤的肾小管上皮细胞可能通过释放DAMP激活单核巨噬细胞。基于以上背景,本研究在构建顺铂致肾小管上皮细胞急性损伤模型的基础上,将损伤肾小管上皮细胞上清液作用于单核巨噬细胞,观察单核巨噬细胞内NLRP3炎症小体是否能够被激活,并对在这一体系中NLRP3炎症小体激活的机制进行探讨。1.顺铂对肾小管上皮细胞的损伤目的:构建顺铂致肾小管上皮细胞急性损伤模型,并检测顺铂损伤后细胞增殖、凋亡坏死、ROS水平、释放ATP水平的变化。方法:使用肾小管上皮细胞株NRK-52E细胞。用不同浓度的顺铂作用于NRK-52E细胞。使用细胞计数、MTT、caspase3/7试剂盒检测细胞增殖、凋亡坏死状况。使用流式细胞术、免疫荧光染色检测细胞内ROS及线粒体ROS水平。使用ATP试剂盒、免疫荧光染色方法检测ATP释放水平。结果:顺铂作用于肾小管上皮细胞后能抑制细胞增殖,随顺铂浓度增加,细胞坏死比率升高,细胞内ROS水平上调,细胞内ATP释放至胞外致胞外ATP水平增高。小结:顺铂损伤的肾小管上皮细胞,增殖下降,细胞坏死增加,胞内ROS上升,胞外ATP水平升高。2.顺铂损伤的肾小管上皮细胞可激活巨噬细胞内NLRP3炎症小体目的:将顺铂损伤肾小管上皮细胞的上清液作为条件培养基,作用于THP-1(巨噬细胞)。通过PCR、免疫印迹、ELISA法检测巨噬细胞NLRP3炎症小体的激活,并用不同的抑制剂作用于损伤的巨噬细胞,从而明确顺铂损伤肾小管上皮细胞对巨噬细胞内NLRP3炎症小体的激活作用。方法:将20μM顺铂损伤NRK-52E细胞后48h的上清液作为条件培养基,作用于THP-1细胞,通过PCR、免疫印迹、ELISA检测IL-1β核酸及蛋白水平,使用 NF-κB 抑制剂 Bay1 1-7082、泛 caspase 抑制剂 Z-VAD-FMK、caspase-1抑制剂Z-YVAD-FMK、抗氧化剂Ebselen、NAC、ATP敏感的K+通道抑制剂格列本脲、KCl、P2X受体抑制剂PPADs作用于损伤THP-1细胞,检测IL-1β蛋白水平的变化。结果:顺铂损伤的肾小管上皮细胞上清液可激活巨噬细胞内NLRP3炎症小体,其激活依赖于NF-κB及caspase-1,抑制巨噬细胞K+外流、阻断巨噬细胞膜K+通道、阻断巨噬细胞膜P2X受体及降低巨噬细胞内ROS水平能抑制NLRP3炎症小体激活。小结:顺铂损伤的肾小管上皮细胞可释放DAMP激活巨噬细胞内NLRP3炎症小体,NLRP3炎症小体的活化与胞内K+外流、胞膜ATP受体活化及胞内ROS上调相关。3.顺铂损伤的肾小管上皮细胞可通过释放ATP激活巨噬细胞内NLRP3炎症小体目的:探讨顺铂损伤的肾小管上皮细胞释放的ATP激活巨噬细胞NLRP3炎症小体的机制。方法:使用ATP清除剂Apyrase清除条件培养基中ATP,应用抗氧化剂NAC预处理NRK-52E细胞降低条件培养基中ATP水平,再将条件培养基作用于THP-1细胞,应用免疫印迹及ELISA检测巨噬细胞释放IL-1β水平。使用P2受体抑制剂Suramin、P2X受体抑制剂PPADs、P2X7受体抑制剂A-438079作用于THP-1细胞,应用免疫印迹及ELISA检测巨噬细胞释放IL-1β水平变化。结果:清除或降低条件培养基中ATP能抑制NLRP3炎症小体的激活,阻断巨噬细胞膜ATP受体可抑制NLRP3炎症小体的激活。小结:顺铂损伤的肾小管上皮细胞所释放的ATP,可通过作用于巨噬细胞表面核苷酸受体激活巨噬细胞NLRP3炎症小体。4.顺铂损伤的肾小管上皮细胞可通过抑制巨噬细胞自噬激活NLRP3炎症小体目的:探讨顺铂损伤的肾小管上皮细胞对巨噬细胞线粒体自噬的调控以及巨噬细胞内自噬与NLRP3炎症小体激活间的关系方法:检测条件培养基作用于THP-1细胞后细胞内LC3表达水平的变化,阻断NLRP3炎症小体激活后巨噬细胞自噬标志物LC3表达水平的改变及应用免疫荧光方法检测线粒体自噬变化,应用线粒体自噬增强剂Andrographolide调控巨噬细胞内线粒体自噬后检测巨噬细胞线粒体ROS表达及NLRP3炎症小体激活改变。结果:条件培养基作用于巨噬细胞后细胞内自噬抑制。抑制巨噬细胞内炎症小体激活后巨噬细胞自噬上调,而促进巨噬细胞内线粒体自噬可抑制条件培养基对巨噬细胞炎症小体的激活。促进线粒体自噬同时可降低巨噬细胞内线粒体ROS水平。小结:顺铂损伤的肾小管上皮细胞可抑制巨噬细胞内自噬,上调巨噬细胞内线粒体自噬可通过抑制胞内ROS水平抑制NLRP3炎症小体激活。统计方法所有数据均代表3次以上重复实验的结果,以均数±标准差表示,所有统计分析由统计软件SPSS20.0完成。两样本均数的比较采用两独立样本t检验;方差齐的多个样本均数的比较采用One-Way ANOVA,两两比较采用LSD法;方差不齐的多个样本均数的比较采用Welch法,两两比较采用Dunnett’sT3法。p<0.05为差异有统计学意义。结论顺铂损伤的肾小管上皮细胞,可通过释放ATP激活巨噬细胞NLRP3炎症小体,上调巨噬细胞线粒体自噬可抑制损伤的肾小管上皮细胞对巨噬细胞NLRP3炎症小体的激活。