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三叶木通(Akebia trifoliat(Thunb.)Koidz.)是木通科(Lardizabalaceae)木通属(Akebia Decne.)药用藤本植物,属于基部真双子叶植物,在被子植物进化历史上处于重要的过渡地位。关于三叶木通花发育的形态学研究表明:发育早期为两性花结构,后期雄花中的心皮和雌花中的雄蕊分别发生退化,形成功能上的单性花。由此可知三叶木通花是以Ⅰ型单性花途径发育,但其两性花向单性花发育过程中的分子调控机制目前尚不清楚。依据核心真双子叶植物花发育研究提出的“ABCDE”模型,其中的B类基因是决定花瓣和雄蕊发育的器官特征基因,有可能参与植物的性别分化。课题组前期的研究结果表明,B类基因在三叶木通雌雄花中具有不同的时空表达模式,为了继续探究B类基因在三叶木通两性花向单性花发育过程中的调控作用,有必要开展三叶木通B类基因的功能研究。B类基因属于MADS-box转录因子家族,其编码蛋白通过与自身或其它转录因子形成聚合物,调控下游靶基因的转录。因此本研究为了进一步了解三叶木通B类基因中的AktPI和AktAP3-1基因对花性别分化的调控作用和其编码蛋白的作用方式,通过拟南芥异位转化技术研究了AktPI和AktAP3-1基因对拟南芥花器官发育的影响,同时利用亚细胞定位技术、双分子荧光互补技术探究了AktPI及AktAP3-1基因编码蛋白在细胞中的表达部位和相互作用方式。研究结果初步揭示了AktPI及AktAP3-1基因的功能,为认识二者在三叶木通花发育调控分子机制中的作用,和对进一步探究三叶木通两性花向单性花转变的分子机制都具有重要的意义。本研究的结果和结论如下:1.AktPI和AktAP3-1基因在拟南芥中的异位表达研究。构建35S::AktPI和35S::AktAP3-1过表达载体转化拟南芥,AktAP3-1和AktPI转基因植株表现出雄蕊增高的现象。结合前期课题组利用实时定量研究该类基因表达的研究结果:同一时期,雄花心皮中的表达量高于雌花心皮中的表达量,雄花雄蕊中的表达量高于雌花雄蕊中的表达量。推断AktPI和AktAP3-1基因能促进雄蕊发育,抑制雌蕊发育,可能参与三叶木通单性花的形成过程。此外,AktAP3-1和AktPI转基因植株都表现出早花现象,35::AktAP3-1转基因植株表现出茎生叶卷曲,终端花,在终端花的第一轮出现额外的3朵部分花器官缺失的不完全花,形成一个正常发育大小的角果和一个发育异常的小角果。说明AktAP3-1可能参与花序分生组织向花分生组织的转变,而且与拟南芥角果的发育有关。2.AktPI和AktAP3-1基因编码蛋白的亚细胞定位研究。构建p1302-AktPI-GFP和p1302-AktAP3-1-GFP融合表达载体,分别转化洋葱细胞和烟草细胞。结果显示p1302-AktPI-GFP和p1302-AktAP3-1-GFP定位于烟草细胞和洋葱细胞的细胞膜和细胞质。结果表明AktPI和AktAP3-1蛋白可能不具备核定位能力,可能需要和其它转录因子形成复合体,参与调控三叶木通花器官的发育。3.AktPI和A tAP3-1基因编码蛋白间的相互作用研究。构建瞬时表达载体pYNE-AktPI、pYNE-AktAP3-1、pYCE-AktPI和pYCE-AktAP3-1 转化烟草细胞,观察YFP荧光蛋白复性情况。结果表明AktPI与AktAP3-1既可以形成异源二聚体,也可以各自形成同源二聚体。而且根据黄色荧光在烟草细胞中出现的位置,表明AktPI和AktAP3-1蛋白形成的同源二聚体或异源二聚体都定位在烟草细胞质中。说明随着被子植物的进化,旁系同源基因的增多,B类蛋白趋向于形成异源二聚体,调控花器官发育的基因网络越来越复杂。